【摘要】：肝切除術(shù)后肝再生和肝功能保護是決定患者預(yù)后的重要環(huán)節(jié),因此肝切除圍術(shù)期肝缺血再灌損傷是尤其需要關(guān)注的。組織缺血再灌損傷后的修復(fù)和再生過程復(fù)雜,大量的分子途徑被證明與之相關(guān)并發(fā)揮重要作用。NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)介導(dǎo)的炎性小體的激活在細(xì)胞增殖活動中發(fā)揮著重要作用,其中NLRP3炎性小體一直被認(rèn)為是可以感應(yīng)最多種類的外界刺激。但NLRP3炎性小體在肝部分切除(partial hepatectomy,PHx)后的肝再生(liver regeneration)過程中的作用仍然是未知的。目前研究已證明,TLR4/NF-κB信號通路在NLRP3炎性小體的活化以及肝再生的過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用,并且右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)也被證明可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活性來進而保護肝臟缺血再灌注造成的組織損傷。本課題將進一步探索右美托咪定能否促進肝部分切除后的肝再生過程,同時考察右美托咪定在該過程中對炎性小體的活性的影響。第一部分:右美托咪定體外對人正常肝細(xì)胞作用的實驗研究目的:探索右美托咪定對L02人正常肝細(xì)胞的影響及其可能的分子機制。方法:在體外實驗中,觀察不同濃度的右美托咪定的處理對L02人正常肝細(xì)胞的增殖、凋亡的影響。Western印跡檢測TLR4/NF-κB蛋白的表達水平。采用MTT檢測細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果:在體外,右美托咪定能夠明顯抑制L02人正常肝細(xì)胞的增殖,但是不具有劑量依賴性。右美托咪定明顯的降低L02人正常肝細(xì)胞內(nèi)TLR4和NF-κB蛋白的表達水平。結(jié)論:我們推測,右美托咪定抑制人肝細(xì)胞的增殖作用,與其抑制TLR4/NF-κB信號通路的強度的作用有關(guān)。第二部分右美托咪定促進小鼠肝切除后肝再生的實驗研究目的:右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)已經(jīng)被證明是可以保護肝臟缺血再灌注造成的組織損傷,而炎癥在肝再生的過程中發(fā)揮重要作用。因此在本課題中,我們的目的是探索右美托咪定能否促進小鼠肝部分切除后的肝再生過程,同時考察右美托咪定在該過程中對TLR4/NF-κB蛋白的影響。方法:在體內(nèi)實驗中,我們對C57BL/6小鼠進行70%肝部分切除以建立動物模型,作為模型組(PHx group);將單純行腹部切開、肝臟分離后關(guān)閉腹腔的正常小鼠作為假手術(shù)組(sham group);接受右美托咪定治療的模型小鼠隨機分為兩組:在肝部分切除的前30分鐘接受單次腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作為Dex+PHx組;而肝部分切除的前30分鐘、術(shù)后24h、48h、72h分別接受腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作為Dex+PHx+Dex組。觀察Dex對肝切除后肝重/體重比值的影響;檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平;HE染色觀察肝臟組織病理變化;Western印跡檢測TLR4/NF-κB蛋白的表達水平;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-1β和TNF-α水平。結(jié)果:1.與PHx組相比,Dex+PHx組肝臟重量/體重比值的增加明顯升高,而Dex+PHx+Dex組的肝臟重量/體重比值明顯低于PHx組和Dex+PHx組。2.與PHx組相比,在Dex+PHx組,血清ALT和AST水平明顯降低,而Dex+PHx+Dex組血清ALT和AST的水平顯著升高。3.在PHx組血漿中IL-1β和TNF-α與對照組相比顯著增加,Dex+PHx和Dex+PHx+Dex組血漿中IL-1β和TNF-α較對照組升高同時較PHx組顯著降低。4.TLR4和NF-κB在Dex+PHx+Dex組明顯抑制,而PHx組和Dex+PHx組之間沒有顯著差異。結(jié)論:在體內(nèi),小鼠肝部分切除后,TLR4/NF-κB信號通路的活性顯著增強。Dex+PHx組結(jié)果說明右美托咪定對小鼠肝部分切除后的肝再生和肝功能的恢復(fù)具有明顯的的促進作用,這可能與右美托咪定抑制肝部分切除后炎癥反應(yīng)的強度的作用有關(guān)。而Dex+PHx+Dex組的結(jié)果說明過量的右美托咪定能夠抑制小鼠肝部分切除后的肝再生以及抑制肝功能的恢復(fù),而該現(xiàn)象可能與右美托咪定過度抑制TLR4/NF-κB信號通路的強度有關(guān)。所以,術(shù)前給予右美托咪定可以通過抑制炎癥促進了小鼠肝再生和肝臟功能的恢復(fù);但是術(shù)后繼續(xù)給予右美托咪定卻能夠過度地抑制TLR4/NF-κB信號通路,會抑制肝細(xì)胞再生以及肝功能恢復(fù),提示術(shù)前給予右美托咪定可能成為臨床促進肝再生的一種有效的治療策略。第三部分右美托咪定促進小鼠肝切除后肝再生分子機制的實驗研究背景:NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)介導(dǎo)的炎性小體的激活在細(xì)胞增殖活動中發(fā)揮著重要作用。而其中NLRP3炎性小體被認(rèn)為可以感應(yīng)最多種類的外界刺激。但NLRP3炎性小體在肝部分切除(partial hepatectomy,PHx)后的肝再生(liver regeneration)過程中的作用仍然是未知的。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)已經(jīng)被證明可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活性來保護肝臟缺血再灌注造成組織損傷,而該信號通路已經(jīng)被證實在NLRP3炎性小體的活化以及肝再生的過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此在本課題中,我們的目的是探索右美托咪定促進肝部分切除后的肝再生過程中對炎性小體活性的影響。方法:在體內(nèi)實驗中,我們對C57BL/6小鼠進行70%肝部分切除以建立動物模型,作為模型組(PHx group);將單純行腹部切開、肝臟分離后關(guān)閉腹腔的正常小鼠作為假手術(shù)組(sham group);接受右美托咪定治療的模型小鼠隨機分為兩組:在肝部分切除的前30分鐘接受單次腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作為Dex+PHx組;而肝部分切除的前30分鐘、術(shù)后24h、48h、72h分別接受腹腔注射右美托咪定(25μg/kg)的小鼠作為Dex+PHx+Dex組。western印跡檢測NLRP3炎性小體,ACS,Caspase-1等蛋白的表達水平。結(jié)果:在體內(nèi),小鼠肝部分切除后NLRP3炎性小體的活性升高,cleaved-caspase-1,ACS表達上調(diào),IL-1β和TNF-α在PHx組血漿中與對照組相比顯著增加。Dex+PHx和Dex+PHx+Dex組均明顯抑制了炎癥反應(yīng)。結(jié)論:右美托咪定預(yù)處理可以通過抑制NLRP3炎性小體的活性防止PHx后肝臟的炎癥損傷,從而促進了肝再生和肝臟功能的恢復(fù)。但預(yù)處理和后處理時,過量的右美托咪定會過度地抑制NLRP3炎性小體的活性,從而降低炎性細(xì)胞因子的表達活化及分泌。伴隨TLR4/NF-κB活性的降低,肝細(xì)胞再生以及肝功能恢復(fù)也會抑制,說明TLR4/NF-κB信號通路及其介導(dǎo)的反應(yīng)在肝切除后肝再生過程中發(fā)揮著微妙的作用,只有適當(dāng)?shù)囊种撇趴梢源龠M肝再生。
【圖文】：

圖 1 L02 細(xì)胞增殖率1.右美托咪定抑制 L02 肝細(xì)胞增殖。L02 細(xì)胞用不同濃度的右美托咪定孵育 24 小時。測細(xì)胞增殖率。值為檢測處的吸光度。四個獨立實驗的數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD。np＜0.01 vs 對照。 右美托咪定抑制人肝細(xì)胞內(nèi) TLR4/NF-κB 信號通路活性

為了進一步探討 TLR4 和 NF-κB 在肝細(xì)胞增殖的作用，L02 細(xì)胞在 20μM 的右美托咪定處理后，利用 Western blot 檢測蛋白表達，，結(jié)果（圖 2）表明，TLR4 和NF-κB 蛋白表達明顯下降，提示右美托咪定抑制肝細(xì)胞增殖的作用，可能取決于其對 TLR4 和 NF-κB 抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R614

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1 解景東;楊寶山;;肝再生機制研究現(xiàn)況[J];肝臟;2014年12期

2 李瀚e

本文編號：2589304