【摘要】：目的:探究干細(xì)胞對皮膚修復(fù)與再生作用及關(guān)鍵調(diào)控因子。一方面,觀察間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的培養(yǎng)基對光老化表皮細(xì)胞的修復(fù)再生作用,研究有效分泌因子及其作用機制,為皮膚抗老化及去分化提供新的方法。另一方面,在前期研究的基礎(chǔ)上,利用去分化源性表皮干細(xì)胞對人配對盒(Pairedbox6,Pax6)基因DNA甲基化調(diào)節(jié)在汗腺再生過程中的關(guān)鍵作用進(jìn)行驗證,并對汗腺樣細(xì)胞進(jìn)行安全性評價,進(jìn)一步分析關(guān)鍵調(diào)控因子誘導(dǎo)汗腺再生的作用機制。方法:利用定量紫外線照射人永生化表皮細(xì)胞(HaCaT)構(gòu)建表皮細(xì)胞光老化模型,培養(yǎng)人絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞(CDSCs),將不同濃度的人絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞上清液(CDSC-CNM)作用光老化表皮細(xì)胞,通過細(xì)胞遷移、熒光探針、彗星分析實驗等測定細(xì)胞增殖、活性氧自由基(radical oxygen species, ROS)生成量、DNA損傷的變化,觀察其抗老化修復(fù)再生作用;檢測有效分泌因子,并通過Western blot測定相關(guān)通路蛋白,分析其作用機制。構(gòu)建Pax6真核表達(dá)載體,培養(yǎng)去分化源性表皮干細(xì)胞,設(shè)置實驗分組。將Pax6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至去分化源性表皮干細(xì)胞并通過G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,加入甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)繼續(xù)培養(yǎng),利用Realtime-PCR檢測Pax6的mRNA表達(dá)情況,應(yīng)用免疫熒光法檢測C E A、C K7等汗腺標(biāo)志物,并進(jìn)行裸鼠腳掌汗腺移植再生的驗證及安全性評價。結(jié)果:成功構(gòu)建了人表皮細(xì)胞光老化模型,一定濃度的CDSC-CNM對光老化表皮細(xì)胞有修復(fù)再生作用,可以有效增強細(xì)胞活力、減少ROS生成量并減輕DNA損傷程度。CDSC培養(yǎng)基檢測發(fā)現(xiàn),表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-6 (IL-6)及IL-8可能為有效的分泌因子,并通過JAK/STAT、MAPK等信號通路機制發(fā)揮作用。構(gòu)建了 Pax6真核質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Pax6質(zhì)粒的去分化源性表皮干細(xì)胞經(jīng)過G418篩選后形成陽性克隆,Realtime-PCR及Western blot結(jié)果顯示,Pax6+5-Aza-dC組細(xì)胞中CEA、CK7的mRNA及蛋白均有表達(dá),免疫熒光染色結(jié)果顯示,Pax6+5-Aza-dC組細(xì)胞的CEA、CK7蛋白呈陽性表達(dá)。碘淀粉發(fā)汗實驗結(jié)果顯示,大約7/10使用Pax6+5-Aza-dC組細(xì)胞進(jìn)行腳掌移植的裸鼠可見陽性結(jié)果,組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),HE染色切片中Pax6+5-Aza-dC組可見再生的汗腺結(jié)構(gòu),皮膚基底層部位的汗腺導(dǎo)管相互連接,而對照組則沒有發(fā)現(xiàn)類似汗腺的結(jié)構(gòu)。接種汗腺樣(SGL)細(xì)胞的實驗組接種處沒有出現(xiàn)腫物,接種胃癌(MGC-803)細(xì)胞的對照組三周(w)后顯示背部腫物,組織切片觀察,實驗組的組織中未見異�；蚰[瘤細(xì)胞而對照可見大量異型腫瘤細(xì)胞組織。結(jié)論:人絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞上清液對人光老化表皮細(xì)胞具有修復(fù)再生作用,其中b-FGF、EGF、TGF-β、IL-6及IL-8等細(xì)胞分泌因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用,這為皮膚抗老化的預(yù)防治療提供了新的方法,也為表皮細(xì)胞去分化提供了誘導(dǎo)條件。Pax6和5-Aza-dC共同作用可以促使去分化源性表皮干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為SGL細(xì)胞,并表達(dá)出CEA、CK7等汗腺特異性標(biāo)志物,驗證了 SGL細(xì)胞在裸鼠模型中的生物學(xué)功能,移植瘤實驗證明了 SGL細(xì)胞的安全性,為臨床大面積汗腺損傷的患者實現(xiàn)汗腺再生帶來希望。通過深入探討Pax6甲基化調(diào)控機制,汗腺再生的理論體系將進(jìn)一步得到完善。
【圖文】：

３．結(jié)果逡逑３．１邋ＣＤＳＣ細(xì)胞的表面抗原特征逡逑顯微鏡下觀察，ＣＤＳＣ為成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖１Ａ）。流式細(xì)胞儀顯示，ＣＤＳＣｓ逡逑表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞（ＭＳＣｓ）的特異性表型，ＣＤ７３、ＣＤ９０和ＣＤ１０５表面抗原呈陽性，逡逑ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５和ＨＬＡ－ＤＲ表面抗原呈陰性（圖１Ｃ）。逡逑ＭＢ逡逑Ｃ邐ＣＤ７３邐ＣＤ９０邐ＣＤ１０５逡逑｜：ｊ邐Ｉ］邐！逡逑Ｉ：卜１￣￣『ｉ；：丨邋ｆ邋Ｉ逡逑：NB美：１丨，廔Ｊ邐■贏Ｉ逡逑Ｋｒ邋ｔｏ＇邋Ｕｒ邋ｔｏ３邋１０邋ｉ0°邋ｉ0＇邋Ｗｒ邋ｉ（ｒ邋ｉ＃rP々g纆篯3?９７．９９％邐９７．３５％邐９７．４６％逡逑ＣＤ１９邐ＣＤ３４邐ＣＤ４５邐ＨＬＡ－ＤＲ逡逑ｉｒ邐ｉｒ逡逑ｌｌ邋４邋１邐＾邋ｌｌ邋Ｌ邋１邐＾邋ＩＩＩ邋Ａ邋１邐＾邋Ｉｄ邋Ｉｋ邋１邐＾邋｜逡逑Ｔ邐Ｔｏ３邋１０４邐＜０？邐＇？＊邐１０°邐Ｉ０１邋ｌ0２邋｜0３邐１０＊逡逑１．０６％邐０．１８％邐０．５９％邐０．７５％逡逑圖１胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。（Ａ）胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)，表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞逡逑樣形態(tài)（ｘｌＯＯ）。（Ｂ）正常ＨａＣａＴ細(xì)胞形態(tài)。（Ｃ）流式細(xì)胞儀分析顯示ＣＤＳＣｓ具有間充質(zhì)干逡逑細(xì)胞的特異性表型，表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５呈陽性，ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ逡逑呈陰性。逡逑１８逡逑

正常的ＨａＣａＴ細(xì)胞培養(yǎng)在ＧＭ中，細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)呈上皮樣，多角形（圖逡逑１Ｂ）。經(jīng)過定量ＵＶＢ輻射后形成光老化的ＨａＣａＴ細(xì)胞，通過ＧＭ、ＣＭ繼續(xù)培養(yǎng)檢逡逑測，其細(xì)胞增殖率與正常ＨａＣａＴ細(xì)胞相比明顯下降（圖２）。逡逑國邐｜逡逑＾邋２．５０邋－｜邐ＤＮｏｒｍ＾ｌｌＵＣ＾Ｔｃｅｍ逡逑§逡逑Ｓ邐＾邐ＰＰｔｉｏｔｏ＾ａｇｅｄ邋ＨａＣａＴ邋ｃｅｌｌｉ逡逑ｇ邋２．栜－邋工0一邐＊逡逑翁邐＿ＬＺ？逡逑Ｓ邋％Ｍ邋－逡逑��？}0—１－６８Ｓ逡逑ｇ逡逑＾邋ａｓｏ邐－邐？邐＾逡逑Ｗ邐邋邋ＷＫＥｍ逡逑－邋—逡逑９．ｍ邐Ｕ邐ｊ邐邐Ｐ＊＊＂—，逡逑ＧＭ邐ＣＭ逡逑圖２成功建立了光老化表皮細(xì)胞模型。培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基（ＧＭ）和對照培養(yǎng)基（ＣＭ）中的光老化逡逑ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖率與正常表皮細(xì)胞增殖率相比均明顯降低。逡逑３．３邋ＣＤＳＣ－ＣＮＭ提高光老化ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖率逡逑盡管光老化ＨａＣａＴ細(xì)胞比正常ＨａＣａＴ細(xì)胞的細(xì)胞增殖率明顯下降，但光老化逡逑ＨａＣａＴ細(xì)胞經(jīng)ＣＤＳＣ－ＣＮＭ作用后，其細(xì)胞增殖率比ＣＭ作用后有明顯X椉�。其中，，辶x顯鮒陳試齜畬蟮氖薔罰擔(dān)ィ茫模櫻茫茫危妥饔煤蟮墓飫匣齲幔茫幔韻赴ㄍ跡常ｅ義希保瑰義

本文編號：2573586