【摘要】：目的:探求一種穩(wěn)定可靠的建立肝纖維化小鼠70%肝切除模型的方法,為具有基礎肝病小鼠行肝切除術后相關研究提供技術支持。比較正常及肝纖維化小鼠行肝臟大范圍切除后的肝再生情況,研究肝纖維化對肝切除后肝臟損傷和肝再生的影響。探討白細胞介素-22(IL-22)對CCl_4誘導的肝纖維化小鼠行70%肝部分切除術后肝臟再生的促進作用及機制研究。方法:第一部分,66只C57/BL6小鼠隨機挑選6只作為病理對照組,對比觀察小鼠肝纖維化模型肝臟的病理纖維化程度,剩余60只小鼠先誘導肝纖維化,隨后隨機均分為傳統(tǒng)組(單純結扎摘除肝葉)和改良組(阻斷血流后摘除肝葉)建立70%肝切除模型。每組隨機挑選6只小鼠分別于肝切除術前和術后12 h,24 h,48 h,72 h 5個時間點處死小鼠,收集肝臟組織及血液標本。記錄并觀察術后兩組的成活率,并發(fā)癥的發(fā)生情況;檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平觀察肝損傷;計算肝質(zhì)量/體質(zhì)量比值、檢測細胞增殖細胞核抗原(PCNA)表達來觀察兩組肝再生差異。第二部分,120只C57/BL6小鼠隨機分為對照組和實驗組,每組各60只。實驗組背部皮下注射40%CCl_4玉米油溶液誘導肝纖維化模型,對照組給予同等劑量的玉米油處理。6周后肝纖維化成模,兩組行肝左、中葉切除。分別于術后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h處死小鼠,采集血液標本與殘存肝臟組織,檢測血清ALT、AST水平,肝組織病理,肝重體重比值和增殖細胞核抗原(PCNA),觀察肝臟損傷及再生差異。第三部分,144只C57/BL6小鼠,隨機分成PHx組(單一70%肝切除組)、CCl_4纖維化組、CCl_4+PHx組(CCl_4誘導肝纖維化后行70%肝切除組)和CCl_4+IL-22+PHx組(肝纖維化后經(jīng)IL-22干預后再行70%肝切除組),各組分別于術后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h各處死6只,收集血液標本,檢測血清ALT、AST及ALB水平,計算ALT/AST值,觀察各組各時間點肝臟損傷情況。收集肝臟組織標本,稱肝葉重量計算肝體重比,病理觀察各時間點的肝臟纖維化程度和病理損傷,檢測不同時間點肝臟細胞增殖細胞核抗原(PCNA)陽性表達數(shù)量,Western Blot檢測細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)水平及細胞周期改變情況。結果:第一部分,(1)與對照組相比,傳統(tǒng)組與改良組小鼠正常肝小葉結構破壞,匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見大量假小葉,中央靜脈周圍可見炎性浸潤,傳統(tǒng)組與改良組小鼠肝纖維化模型建模成功。(2)肝部分切除術后,相比傳統(tǒng)組,改良組小鼠的成活率顯著升高(96.67%vs.73.33%),術中出血和術后腔靜脈狹窄及膽漏并發(fā)癥的發(fā)生率明顯降低(P0.05)。(3)術后12 h和24 h傳統(tǒng)組的ALT和AST水平高于改良組,而各組內(nèi)ALT、AST均出現(xiàn)先增高后降低的趨勢(P0.05)。(4)術后2組肝質(zhì)量/體質(zhì)量比值均出現(xiàn)增長趨勢,PCNA表達數(shù)均于術后開始升高,48 h達到高峰后下降(P0.05),但2組間各時間點2指標差異均無統(tǒng)計學意義。第二部分,(1)與對照組相比,肝切除后,實驗組各時間點ALT、AST顯著升高(P0.05);(2)肝臟病理顯示,實驗組正常肝小葉破壞,有假小葉形成,肝細胞索排列紊亂,肝細胞出現(xiàn)變性壞死,損傷較重,而對照組肝小葉及細胞形態(tài)正常,損傷較輕;(3)肝體重比及PCNA檢測顯示,相對于對照組,實驗組肝再生延遲或緩慢,PCNA陽性表達細胞數(shù)下降。第三部分,(1)術后24 h,48 h,72 h CCl_4+IL-22+PHx組小鼠血清ALT/AST值明顯高于CCl_4+PHx組;術后48 h,72 h CCl_4+IL-22+PHx組小鼠血清ALB水平較CCl_4+PHx組顯著升高。(P0.05)(2)術后CCl_4+IL-22+PHx組小鼠肝再生顯著增快,術后24h,48h,72h CCl_4+IL-22+PHx組小鼠肝體重比(2.34±0.07,3.23±0.09,3.55±0.09)明顯高于CCl_4+PHx組(2.08±0.16,2.77±0.07,2.97±0.14),且肝組織的病理損傷明顯減輕。(P0.05)(3)CCl_4+PHx組術后24 h,48 h,72h PCNA陽性表達細胞數(shù)、再生肝組織內(nèi)STAT3蛋白和Cyclin D1蛋白表達量明顯低于其余各組,而CCl_4+IL-22+PHx組PCNA陽性表達細胞數(shù)及再生肝組織內(nèi)STAT3蛋白和Cyclin D1蛋白表達量較CCl_4+PHx組明顯升高。(P0.05)。結論:通過阻斷肝葉血流構建肝纖維化小鼠70%肝切除模型,可顯著提高模型的成功率,降低并發(fā)癥的發(fā)生率;肝纖維化病變可使小鼠大范圍肝切除后肝臟損傷加重,肝再生減緩;在CCl_4誘導的肝纖維化小鼠行70%肝部分切除術后,IL-22對肝臟再生起到顯著的促進作用,且明顯減輕肝組織病理損傷。
【圖文】：

以細胞出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性，計算 PCNA 陽性細胞數(shù)，察看術后兩組肝細胞的增殖差異。1.1.2.6 統(tǒng)計學分析采用 SPSS19.0 進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差別比較采用 t 檢驗，P< 0.05 具有統(tǒng)計學意義。1.2 實驗結果1.2.1 小鼠肝纖維化的造模情況對兩組肝組織進行苦味酸天狼猩紅染色（圖 1）可見，兩纖維化組正常肝小葉結構破壞，匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量纖維組織增生形成假小葉，中央靜脈周圍可見炎性浸潤，肝細胞索排列紊亂伴脂肪變性和壞死。而對照組，正常肝小葉結構存在，肝細胞索排列有序，肝細胞形態(tài)正常。經(jīng)病理鑒定[55]，兩組纖維化模型構建成功，可用于 70%肝切除。（箭頭所示為三組中央靜脈、匯管區(qū)纖維增生情況）對照組 傳統(tǒng)組 改良組

味酸天狼猩紅染色觀察肝纖維化的造模情況（2）全清 ALT、AST 水平，了解小鼠肝功能變化。（3）肝察小鼠肝損傷程度。（4）6 個時間點處死小鼠，秤量肝體重比，以觀察兩組肝再生狀況。（5）免疫組化性表達細胞數(shù)目，，觀察術后兩組肝細胞的增殖狀態(tài)分析SS19.0 進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（用 t 檢驗，P < 0.05 具有統(tǒng)計學意義。果纖維化模型的鑒定情況片苦味酸天狼猩紅染色（圖 1）可見，實驗組正常肝小靜脈周圍纖維組織增生形成假小葉，肝細胞索排列量炎性浸潤，肝細胞出現(xiàn)脂肪變性及壞死，而對照維增生，肝索呈放射狀排列，細胞形態(tài)正常。肝纖下一步實驗的研究。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

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本文編號：2572702