【摘要】：研究背景:近年來,由于生活方式的改變和生存環(huán)境的惡化,我國各種肝臟疾病發(fā)病率呈上升趨勢。目前,多種良惡性肝臟疾病的治療方法最有效的仍然是肝部分切除術,但是切除過大有可能出現(xiàn)肝功能衰竭,切除過小則會引起腫瘤復發(fā)或者不能完全根治肝臟疾病。然而,肝臟與其它臟器不同的是,它具有一定的再生能力。所以,用什么方法可以加快肝細胞增殖的速率成為近年來肝膽科的研究重點。但是,目前研究最多的是怎樣利用藥物保護肝功能,避免肝衰竭,而對其再生機制的研究甚少。如果能夠闡明肝再生的機制,則可以控制其中抑制增殖的環(huán)節(jié),從而加快肝再生速率,使肝衰竭的患者迅速恢復肝功能。但是,肝部分切除術后肝臟再生的機制非常復雜,不是單個肝臟實質器官的再生,而是由于肝切除術后引起的全身各個系統(tǒng)的應激反應,包括各種細胞因子,免疫因子,炎癥因子,以及體內(nèi)多種離子,多個臟器的共同參與。這是研究肝再生機制的難點。Tmub1是近年來在研究肝細胞增殖的過程中發(fā)現(xiàn)的一種含有泛素樣結構域的核-胞漿穿梭蛋白,在正常肝臟的肝細胞內(nèi)主要位于細胞漿中,它包含有1個類似泛素結構的區(qū)域,在增殖周期中,它可以穿梭于細胞漿和細胞核之間,Tmub1蛋白在肝細胞增殖期逐漸向細胞核內(nèi)穿梭,在增殖后期,則幾乎全部穿梭進入細胞核[1-5]。細胞增殖期,細胞核內(nèi)的主要活動是DNA的復制和姐妹染色體的分離,所以Tmub1蛋白應該在細胞核內(nèi)參與了細胞增殖的過程,但是具體的機制目前尚不清楚。Securin即分離酶抑制蛋白,是參與細胞周期調(diào)控的重要物質,質量約22KD,由202個氨基酸殘基組成,在多種腫瘤中高表達[6,7]。在正常的增殖細胞核內(nèi),粘著蛋白復合體使兩條姐妹染色單體相連,活化的分離酶將粘著蛋白復合體分解后,姐妹染色單體分離[7]。securin通過抑制分離酶的活化,從而抑制染色體過早分離,在有絲分裂后期,securin蛋白N末端的毀壞盒與后期促進復合物連接,并在多種酶類參與下被泛素化降解,從而使分離酶活化。securin參與了有絲分裂,凋亡,細胞周期的進程以及DNA的修復等關鍵的細胞活動[7]。我們從結構上分析,tmub1蛋白內(nèi)有泛素樣結構域,而securin蛋白可以與泛素結合,也就是說securin蛋白有泛素結合域,所以tmub1蛋白可與securin蛋白結合。tmub1蛋白在g1期幾乎完全表達于細胞質內(nèi),而當細胞進入g2期則大量穿梭進入細胞核,而此時正是增殖細胞的有絲分裂準備期[3-5]。因此,tmub1蛋白與securin蛋白同時具有結構以及空間的的可結合性。所以,如果能夠證明肝部分切除術后肝細胞增殖的過程中tmub1蛋白能夠與securin結合,并且能夠影響肝細胞的增殖進程,將對我們今后預防和治療肝切除術后肝功能衰竭具有重要的意義,并且對其它器官及細胞的增殖研究也有重要的借鑒作用。研究目的:1.證實肝部分切除術后tmub1蛋白能夠與securin蛋白結合。2.明確tmub1蛋白在肝細胞增殖中的作用。材料方法:1.(1)建立大鼠70%的肝切除模型,動物實驗采用40只大鼠隨機分為5組,每組8只,第一組行肝切除術后直接灌注肝臟并取原代肝細胞,其余4組首先行肝部分切除術,分別于術后12,24,48,72h灌注肝臟并取原代肝細胞。(2)提取原代肝細胞tmub1蛋白和securin蛋白。(3)其中一部分首先進行免疫共沉淀實驗,然后進行western-blot實驗了解tmub1蛋白與securin蛋白的結合及其隨肝切除術后時間的變化趨勢;另外一部分直接進行western-blot實驗,了解細胞內(nèi)tmub1的變化趨勢。2.(1)構建過表達tmub1慢病毒載體及陰性空載體對照。(2)構建沉默tmub1慢病毒載體及陰性空載體對照。3.(1)分別使用沉默tmub1慢病毒載體、過表達慢病毒載體及對應的空載體轉染大鼠brl-3a肝細胞系,得到穩(wěn)定轉染的細胞。(2)轉染后行流式細胞術及mtt檢測細胞周期,各組間細胞周期進行對比,了解tmub1蛋白對肝細胞增殖的作用。結果:1.建立了的穩(wěn)定的大鼠70%肝切除模型。2.通過co-ip技術證實tmub1蛋白和securin間相互結合。免疫共沉淀后進行western-blot得到蛋白條帶顯示tmub1蛋白與securin蛋白在肝切除術后相互結合。從條帶的結果看,在肝切除術后0h條帶灰度值較低,隨著切除術后時間增加逐漸增強,到48h最高,72h再次下降。3.術后Tmub1蛋白western-blot檢測發(fā)現(xiàn)肝切除術后各時相點Tmub1蛋白含量未發(fā)生明顯改變。直接Tmub1蛋白western-blot實驗發(fā)現(xiàn)術后各時相點條帶亮度基本相同,IMAGE J圖像分析軟件分析各組每個灰度值,并進行統(tǒng)計學分析,術后各時相點Tmub1蛋白含量無顯著差異(p0.05)。4.成功構建了過表達Tmub1慢病毒載體、陰性空載體對照及沉默Tmub1慢病毒載體、陰性空載體對照。5.通過LV-Tmub1、LV-Tmub1陰性空載體對照及LV-Tmub1-RNAi、LV-Tmub1-RNAi陰性空載體對照轉染各組細胞與正常生長的BRL-3A細胞組提取總蛋白,western-blot檢測發(fā)現(xiàn)過表達組Tmub1蛋白條帶明顯增強,而沉默組條帶明顯減弱,IMAGE J圖像分析軟件分析各組每個灰度值,并進行統(tǒng)計學分析,過表達組Tmub1蛋白條帶與沉默組條帶差異有統(tǒng)計學意義(p0.01),其它各組之間差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。6.MTT實驗檢測細胞增殖將LV-Tmub1、LV-Tmub1陰性空載體對照及LV-Tmub1-RNAi、LV-Tmub1-RNAi陰性空載體對照轉染各組細胞與正常生長的BRL-3A細胞培養(yǎng)48小時后,進行MTT比較,通過酶標儀檢測各組OD值,發(fā)現(xiàn)過表達Tmub1慢病毒載體轉染的肝細胞OD值明顯高于沉默Tmub1慢病毒載體轉染的肝細胞。7.流式細胞術檢測細胞周期通過Tmub1過表達慢病毒載體(LV-Tmub1)、陰性空載體對照及Tmub1沉默慢病毒載體(LV-Tmub1-RNAi)、陰性空載體對照轉染各組細胞后,與正常生長的BRL-3A細胞進行比較,通過流式細胞儀檢測各細胞周期,發(fā)現(xiàn)過表達Tmub1慢病毒載體轉染的肝細胞G2+S期明顯高于沉默Tmub1慢病毒載體轉染的肝細胞G2+S期,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。結論:1.肝部分切除術后Tmub1蛋白與securin蛋白結合。2.Tmub1在肝切除術后12小時開始從胞漿中穿梭進入細胞核,并與securin蛋白相互結合,48小時到達高峰后逐漸下降,而細胞內(nèi)Tmub1蛋白本身的含量并未發(fā)生明顯改變。3.Tmub1蛋白能夠促進肝細胞增殖。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R657.3

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本文編號：2569259