【摘要】：【目的】本研究旨在應(yīng)用ElectroForce3200力學試驗儀搭載的BioDynamic生物反應(yīng)艙,結(jié)合使用Sylgard184硅橡膠薄膜載體,對體外培養(yǎng)的雪旺細胞(Schwann Cells,SCs)施加不同頻率參數(shù)單軸向循環(huán)牽張應(yīng)力(Cyclic Tensile Strain,CTS)。觀察SCs的形態(tài)、分布以及增殖活性的變化并檢測SCs神經(jīng)營養(yǎng)因子和成髓鞘基因的表達和細胞骨架肌動蛋白的變化,探究CTS加載于體外培養(yǎng)SCs后的神經(jīng)修復(fù)相關(guān)生物學行為,選擇適宜的CTS刺激頻率參數(shù),并為CTS結(jié)合SCs應(yīng)用于脊髓損傷臨床治療提供新的方向和理論基礎(chǔ)�！痉椒ā勘狙芯繉Cs進行體外分離培養(yǎng)和傳代,將SCs嘗試接種于擁有良好生物相容性和力學性能的Sylgard184基底膜上進行體外培養(yǎng),配合使用ElectroForce3200力學測試儀,以5%形變量對SCs施以時長為6小時的CTS,并依照加載頻率分為對照組(0Hz)、0.25Hz和0.5Hz,共3組。通過相差顯微鏡觀察力學加載后細胞形態(tài)、分布情況;使用CCK-8法觀察加載后SCs的增殖情況;通過實時定量PCR(Quantitative Real-time-PCR)和免疫印跡法(Western blot)檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子和成髓鞘基因在力學加載后表達的變化;使用免疫熒光染色(Immunofluorescent staining)檢查力學加載后細胞骨架肌動蛋白的變化及其與成髓鞘基因表達改變的聯(lián)系,獲取實驗數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學分析�！窘Y(jié)果】本研究成功構(gòu)建體外培養(yǎng)SCs的CTS加載模型,精確地對體外培養(yǎng)的SCs施加不同頻率的CTS刺激。實驗結(jié)果表明:對照組(0Hz)SCs形態(tài)及分布無明顯改變,0.25Hz組SCs形態(tài)飽滿,細胞排列方向呈極性分布(與牽拉方向一致),0.5Hz組的SCs出現(xiàn)局部脫落,散在分布;通過qPCR和Western blot驗證和CCK-8檢測增殖情況,結(jié)果表明培養(yǎng)0.25Hz組SCs至第7天時,其增殖活性高于其余兩組(P0.05),且0.25Hz組CTS較其余兩組顯著促進SCs神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、NGF、NT-3)的合成與分泌,并上調(diào)成髓鞘基因Krox-20和MAG的表達(P0.05);同時,免疫熒光染色法顯示經(jīng)過CTS刺激后Krox-20基因表達增強,并可觀察到F-actin向SCs核周聚集趨勢�！窘Y(jié)論】SCs促進神經(jīng)修復(fù)的相關(guān)生物學功能受到所加載CTS的影響和調(diào)控。本研究證實SCs的形態(tài)、分布以及增殖活性均可受到所加載CTS的影響:適宜頻率的CTS刺激可使SCs胞質(zhì)更加充盈,細胞排列具有方向性(與牽拉方向一致),過高頻率的CTS刺激不利于SCs在基底膜的附著;適宜頻率的CTS作用于SCs可以促進細胞增殖;上調(diào)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、NGF、NT-3)的合成與分泌并上調(diào)重要成髓鞘基因Krox-20和MAG的表達。SCs經(jīng)CTS刺激后,成髓鞘基因Krox-20表達的改變可能是由細胞骨架F-actin所介導,但其具體機制仍需進一步探索。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 循環(huán)牽張應(yīng)力對雪旺細胞形態(tài)和增殖的影響狀排列。將第三代的 SCs 使用免疫化學 S-100 染色鑒定，在光鏡下對細胞形態(tài)進行觀察：體積相對較小，，外形為長梭形的雙極或多極形態(tài)，胞核較亮，突起較暗，染色呈綠色即 SCs。成纖維細胞通常呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)且并未被染色。細胞S-100 染色后顯示純度良好，為后續(xù)提供了研究基礎(chǔ)（圖 3）。1.2.2 循環(huán)牽張應(yīng)力對雪旺細胞形態(tài)的影響各頻率刺激下 SCs 形態(tài)在鏡下觀察形態(tài)呈現(xiàn)較明顯差異。對照組（0Hz）：SCs 無特殊改變且無明顯極性分布；0.25Hz 組：SCs 形態(tài)較飽滿，排列方向呈現(xiàn)一定的規(guī)律性分布；0.5Hz 組：部分區(qū)域無 SCs 附著，依然附著的 SCs 分散生長且排列無規(guī)律性（圖 4）。

士學位論文 循環(huán)牽張應(yīng)力對雪旺細胞形態(tài)和應(yīng)力對雪旺細增殖的影響加形變率 5%的 CTS 作用 6 小時，頻率分為對照組（0完成后 3 天，5 天，7 天應(yīng)用 CCK-8 檢測 SCs 增殖活之后的第 7 天，0.25Hz 組與 0Hz 組，0.25Hz 與 0.5Hz意義（P＜0.05），提示 0.25Hz 組 SCs 在第 7 天的增殖第 3 天和第 5 天各組 OD 值之間則無明顯統(tǒng)計學差異被認為是刺激 SCs 增殖的適宜頻率，為后續(xù)實驗提供
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R651.2

【參考文獻】

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1 胡新永;王義生;殷力;陳建文;王振軍;李欣浩;;牽張應(yīng)力對成骨細胞增殖和誘生型一氧化氮合酶基因表達的影響[J];中華實驗外科雜志;2016年10期

2 Yong Guo;Qi Lv;Xian-qiong Zou;Zhi-xiong Yan;Yu-xian Yan;;Mechanical Strain Regulates Osteoblast Proliferation Through Ca~(2+)-CaMK-CREB Signal Pathway[J];Chinese Medical Sciences Journal;2016年02期

3 郭巍;李巖;劉q

本文編號：2569255