【摘要】：目的:復(fù)蘇低溫凍存的人退變髓核細(xì)胞,并觀察其活力;體外篩選最佳Fas-si RNA并構(gòu)建其慢病毒載體;Sox9、Fas及Sox9聯(lián)合Fas體外轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞,并研究它們?cè)隗w外對(duì)人退變髓核細(xì)胞的影響。方法:復(fù)蘇液氮儲(chǔ)存的人退變椎間盤髓核細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并觀察其活力情況。設(shè)計(jì)Fas-si RNA-慢病毒載體,經(jīng)酶切和基因測(cè)序鑒定重組克隆,對(duì)Fas-si RNA進(jìn)行慢病毒包裝,并檢測(cè)其滴度。將Sox9過(guò)表達(dá)和Fas干擾以慢病毒為載體在體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,為了便于熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率,用紅色熒光標(biāo)記Sox9基因,藍(lán)色熒光標(biāo)記Fas基因。實(shí)驗(yàn)分為(1)空白對(duì)照組;(2)陰性對(duì)照組;(3)Sox9過(guò)表達(dá)組;(4)Fas干擾組;(5)Sox9過(guò)表達(dá)+Fas干擾組。攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞72h后,通過(guò)熒光顯微鏡觀察,而檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率;CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況;RT-PCR檢測(cè)各組Sox9、Fas、Ⅱ型膠原、蛋白多糖在m RNA水平的表達(dá)情況;Western-Blot分別檢測(cè)各組Ⅱ型膠原、蛋白多糖在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。結(jié)果:人退變髓核細(xì)胞成功復(fù)蘇培養(yǎng)后,細(xì)胞生長(zhǎng)正常、狀態(tài)良好。經(jīng)酶切及重組克隆基因測(cè)序鑒定顯示,應(yīng)用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建Fas-si RNA慢病毒載體,檢測(cè)滴度大于1x108TU/ml。熒光顯微鏡觀察72h后(3)、(4)、(5)組的載體轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞其轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80%以上。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示與(1)組相比(2)組細(xì)胞增殖變化不大,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)組、(4)組、(5)組與(1)組相比細(xì)胞增殖率均有明顯增高,其中(5)組的細(xì)胞增殖率增高最為顯著,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)方法證實(shí)在Sox9、Fas、Ⅱ型膠原和蛋白多糖m RNA表達(dá)水平上(1)組與(2)組相比變化不大,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)組中Sox9的m RNA表達(dá)升高明顯,(4)組中Fas的m RNA表達(dá)水平降低明顯,(5)組中Sox9的m RNA表達(dá)水平升高最為顯著、Fas的m RNA表達(dá)水平降低最為顯著,與(1)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明與(1)組相比(2)組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)變化不明顯,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)組、(4)組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)均有明顯升高,(5)組升高最為顯著,與(1)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的Fas-si RNA可以顯著抑制人退變髓核細(xì)胞中Fas基因的表達(dá);上調(diào)Sox9基因的表達(dá)及沉默F(xiàn)as基因的表達(dá)能夠增加人退變髓核細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sox9和Fas基因與椎間盤退變有相關(guān)性,通過(guò)此生物學(xué)效應(yīng)有望阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。
【圖文】：

結(jié)果結(jié)果復(fù)蘇后形態(tài)觀察退變髓核細(xì)胞復(fù)蘇后，，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓形狀（如圖 1），培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 周，顯微鏡下觀察人退變髓核細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈長(zhǎng)梭常，狀態(tài)良好（如圖 2）。

狀態(tài)良好（如圖 2）。圖 1 人退變髓核細(xì)胞復(fù)蘇未貼壁時(shí)形態(tài)圖2 人退變髓核細(xì)胞貼壁后形態(tài)2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) Fas 干擾效果可以看出三條 Fas-siRNA 干擾效果都比較明顯（如圖 3)，而 Fas-siRNA-1053 干擾效果最佳，選擇 Fas-siRNA-1053 進(jìn)行慢病毒包裝。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R681.53

【參考文獻(xiàn)】

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