發(fā)布時間：2019-11-09 04:36

【摘要】：研究背景和目的:腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白-8樣分子2(tumor necrosis factor-αinduced protein 8 like-2, TIPE2)在機體免疫細胞內(nèi)存在表達,可能參與燒傷后膿毒癥的病理生理過程。但TIPE2表達是否影響樹突狀細胞(dendritic cells, DC)的免疫功能迄今尚不清楚。實驗方法:1.采用免疫磁珠法分離正常BALB/c小鼠脾臟DC。采用激光共聚焦技術(shù)精確定位DC細胞內(nèi)TIPE2的表達;應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot檢測TIPE2在DC細胞中的基因和蛋白表達水平。體外實驗部分將攜帶TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至DC細胞,抑制/上調(diào)DC細胞內(nèi)TIPE2基因/蛋白的表達;體內(nèi)實驗部分通過尾靜脈注射攜帶TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒載體,飼養(yǎng)兩周待表達穩(wěn)定后,復(fù)制小鼠重度燙傷模型。DC細胞表面抗原、共刺激分子和抗原呈遞分子采用流式細胞術(shù)檢測;DC對T淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響應(yīng)用CCK-8法檢測;DC自身分泌的細胞因子、DC/T共培養(yǎng)上清液中細胞因子水平的變化及T淋巴細胞核內(nèi)活化T細胞的核因子(nuclear factor of activated T cells,NF-AT)活性采用ELISA檢測。統(tǒng)計學(xué)方法:計量資料用x±s表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析各組數(shù)據(jù),倆樣本間比較采用t檢驗,單因素多組數(shù)據(jù)進行方差分析(One-WayANOVA)。以P0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。主要結(jié)果和結(jié)論:1.激光共聚焦顯微鏡成像分析顯示TIPE2在DC胞漿中表達,TIPE2在DC內(nèi)存在基因和蛋白表達。2.流式結(jié)果顯示,CD80、CD86及主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ類分子(MHC-Ⅱ)表達在TIPE2沉默DC細胞組顯著增強,TIPE2過表達組3種表面分子的表達均明顯降低。小鼠燙傷24h后,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組DC表面3種分子表達均較燙傷組出現(xiàn)顯著上調(diào),TIPE2 RNA轉(zhuǎn)染組其表達則明顯下調(diào)(P，0.01)。3. ELISA結(jié)果顯示,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組DC細胞上清液中檢測到較高水平IL-12、TNF-α(P0.01)。小鼠嚴重燙傷后,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組IL-12、TNF-α生成量顯著升高,而TIPE2RNA轉(zhuǎn)染組兩種細胞因子水平明顯降低(P0.01)。4. CCK8法檢測顯示,沉默TIPE2表達后T細胞增殖活性較正常組增強。小鼠燙傷24h后,siRNA-TIPE2轉(zhuǎn)染組T細胞增殖活性明顯增強,TIPE2上調(diào)組T細胞增殖活性則顯著減弱(P0.01)。5. TIPE2-RNA轉(zhuǎn)染DC細胞后,IL-2水平及T細胞NF-AT活性顯著降低。燙傷24 h后TIPE2 RNA轉(zhuǎn)染組IL-2水平及T細胞NF-AT活性較燙傷組明顯降低,TIPE2 siRNA轉(zhuǎn)染組IL-2生成量及T細胞NF-AT活性顯著升高(P0.01)。6. TIPE2 siRNA轉(zhuǎn)染DC細胞后,IFN-γ生成量增加,IL-4生成量下降,T細胞向輔助性T細胞(Th) 1方向極化。與燙傷組相比,TIPE2 RNA轉(zhuǎn)染組IFN-γ水平降低而IL-4含量升高,TIPE2siRNA轉(zhuǎn)染組,IFN-y水平上升而IL-4含量顯著降低(P0.01)。上述結(jié)果提示,TIPE2可顯著影響嚴重燙傷小鼠DC細胞的分化成熟及其介導(dǎo)的T淋巴細胞功能。
【圖文】：

２．３邋ＤＣ細胞Ｔ１ＰＥ２邋ｍＲＮＡ／蛋白表達逡逑收集分離純化ＤＣ細胞，ＲＴ－ＰＣＲ檢測到１４７邋ｂｐ大小的特異性ＴＩＰＥ２目的基因條逡逑帶（圖２），Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ證實ＤＣ細胞中存在分子量為２１邋ｋＤ的清晰ＴＩＰＥ２條帶（圖２）。逡逑ＣＤ４＋Ｔ淋巴細胞、調(diào)節(jié)性Ｔ細胞和巨噬細胞內(nèi)ＴＩＰＥ２作為陽性對照，ｐ－ａｃｔｉｎ作為內(nèi)逡逑參照。逡逑１３逡逑

正常ＤＣ對照組、ＴＩＰＥ２ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染ＤＣ細胞組、ＴＩＰＥ２ＲＮＡ轉(zhuǎn)染ＤＣ細胞組２４ｈ逡逑后，流式細胞結(jié)果經(jīng)過方差分析顯示，ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ平均熒光強度在ＴＩＰＥ２逡逑沉默ＤＣ細胞組顯著升高（表２－２和圖２－２，，邋Ｐ＝０．０００），ＴＩＰＥ２過表達ＤＣ組３種共刺激分逡逑子的平均熒光強度明顯降低（表２－２和圖２－２，Ｐ＝０．０００）。如上所述，沉默ＤＣ細胞ＴＩＰＥ２逡逑表達后ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ熒光強度均顯著增強，說明ＤＣ細胞內(nèi)ＴＩＰＥ２表達顯逡逑著影響ＤＣ細胞的成熟分化狀態(tài)。此外，小鼠脾臟ＤＣ內(nèi)ＴＩＰＥ２蛋白抑制或過表達效逡逑果滿意（表２－１和圖２－１，邋Ｐ＝０．０００）。逡逑表２－１邋ＤＣ細胞中ＴＩＰＥ２蛋白沉默／過表達效果（三士ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ａｂｕｎｄａｎｃｅ邋ｏｆ邋ＴＩＰＥ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｉｎ邋ＤＣｓ邋（邋ｘ±ｓ）逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R644

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本文編號：2558251