【摘要】：目的：在椎間盤退行性病變過程中,椎間盤內微環(huán)境中IL-1p表達的升高被認為是其重要的致病因素,而間充質干細胞治療椎間盤退行性病變也被認為是具有巨大潛力的治療策略。在眾多實驗中間充質干細胞都表現(xiàn)出良好的髓核細胞分化特性,以及體外實驗中良好的恢復椎間盤高度的能力,本實驗將從體外評價骨髓間充質干細胞(BMSCs)對白介素1p(IL-1β)干預后的髓核(NP)細胞保護修復能力。方法：1.實驗細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定以及實驗分組。一型膠原,二型膠原的細胞免疫組化鑒定。取三代BMSCs通過流式細胞儀進行CD29、CD31、CD45、CD90位點鑒定細胞純度。實驗共分為三組：1.對照組：在無血清培養(yǎng)基條件下24 h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。2.炎性干預組(A組)：在無血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預24h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。3.共培養(yǎng)組(B組)：在無血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預24h后,更換含有完全培養(yǎng)基同時置入預先種入BMSCs細胞的transwell小室,共培養(yǎng)24h,三組實驗都分為2個階段,時間各24h。2.Realtime-PCR:BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預的NP細胞中基因的表達。采用Realtime-PCR檢測三組獲得NP細胞的ADAMTS-4、5、7,MMP-3、13,TIMP-1的基因相對表達量。3.細胞凋亡的檢測：根據(jù)beyotime提供的Caspase-3活性檢測試劑盒說明書,對于三組細胞CASPASE-3的活性進行檢測。同時還對于三組細胞進行TUNEL染色,觀察三組細胞的TUNEL染色的活性,進行比較。BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預的NP細胞凋亡比例變化。取各組NP細胞,使用Annexin V (PE)/PI流式試劑盒檢測凋亡的變化。在流式檢測中,加入直接共培養(yǎng)(C組),使用相同數(shù)量的GFP-BMSCs直接加入炎性因子損失的NP細胞中,觀察四組髓核細胞凋亡數(shù)量的變化。4.細胞遷徙的檢測：對于Ong/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml濃度的IL-1β干預髓核細胞24h,將transwell板由換成8-μm孔徑的濾板,通過四組的比較,觀察BMSCs對于炎性損傷的NP細胞的遷徙能力。5.線粒體染色現(xiàn)象觀察：使用24孔提前鋪片,使用IL-1β(20ng/ml)干預NP細胞24h之后,加入使用帶有GFP熒光的BMSCs, GFP-BMSCs使用線粒體染料預染色,直接接觸共培養(yǎng)24h后,將細胞玻片取出在共聚焦顯微鏡下觀察。結果：1.NP細胞、BMSCs純度鑒定。BMSCs傳至第3代通過流式細胞儀通過CD29、 CD31、CD45、CD90位點鑒定細胞純度,BMSCs的流式鑒定結果顯示90%以上的BMSCs表現(xiàn)為CD29,CD90陽性,小于5%的BMSCs的CD31及CD45陽性,細胞純度較好。髓核細胞免疫組化顯示的二型膠原表達較好,符合NP細胞的膠原表達特點。2.Realtime-PCR結果,相比于對照組,A組中ADAMTS-4,ADAMTS-5, ADAMTS-7,MMP-13,MMP-3表達顯著升高,五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而相比A組,B組各項退變指標基因表達量顯著降低,五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.細胞凋亡檢測：三組細胞TUNEL染色顯示炎性刺激組(A組)髓核細胞凋亡明顯增加,BMSCs共培養(yǎng)組(B組)對于炎性因子導致的凋亡細胞的數(shù)量的增產生有效的抑制。在Caspase-3的檢測中,A組比較對照組caspase-3活性升高明顯,二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),而相比于A組,B組中Caspase-3活性下降,二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。Annexin V (PE)/PI流式結果,與對照組相比,A組NP細胞在炎性因子刺激下凋亡增加明顯,二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。經(jīng)過BMSCs間接共同培養(yǎng)(B組)后,相比于A組,NP細胞凋亡下降明顯,二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。Annexin V(PE)/PI流式結果中,直接共培養(yǎng)的結果(C組)和間接共培養(yǎng)組(B組)對凋亡都有抑制作用,但兩者無統(tǒng)計學差異。4.BMSCs遷徙結果：通過考馬斯亮藍染色后BMSCs細胞數(shù)量的比較,可以發(fā)現(xiàn),IL-1β濃度的不斷升高,即隨著炎性因子對于髓核細胞損傷的程度不斷增加,BMSCs對于髓核細胞的遷徙能力不斷增強。四組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。5.線粒體一體化結果：從圖可以看出GFP-BMSCs可以通過隧道納米管,將線粒體傳輸進炎性損傷的NP細胞內,完成細胞之間的直接營養(yǎng)作用。結論：BMSCs可通過旁分泌的方式,有效降低炎性所致的NP細胞退變和凋亡的比例,說明BMSCs作為種子細胞在椎間盤退行性病變的治療中,對于椎間盤炎性環(huán)境的“治療”作用不可忽視。同時BMSCs可以炎性損傷的NP細胞進行遷移,說明BMSCs可以在椎間盤內炎性內環(huán)境嚴重的部位遷徙,發(fā)揮治療作用,以及我們觀察到在直接共培養(yǎng)的時候,BMSCs可以通過隧道納米管,向損傷的NP細胞傳輸線粒體,通過本實驗的設計可以一定程度上模擬體內干細胞治療過程,為更準確的研究干細胞治療機制提供條件。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53

【共引文獻】

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本文編號：2552328