【摘要】：目的：在椎間盤退行性病變過程中,椎間盤內(nèi)微環(huán)境中IL-1p表達(dá)的升高被認(rèn)為是其重要的致病因素,而間充質(zhì)干細(xì)胞治療椎間盤退行性病變也被認(rèn)為是具有巨大潛力的治療策略。在眾多實驗中間充質(zhì)干細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的髓核細(xì)胞分化特性,以及體外實驗中良好的恢復(fù)椎間盤高度的能力,本實驗將從體外評價骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對白介素1p(IL-1β)干預(yù)后的髓核(NP)細(xì)胞保護(hù)修復(fù)能力。方法：1.實驗細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定以及實驗分組。一型膠原,二型膠原的細(xì)胞免疫組化鑒定。取三代BMSCs通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD29、CD31、CD45、CD90位點鑒定細(xì)胞純度。實驗共分為三組：1.對照組：在無血清培養(yǎng)基條件下24 h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。2.炎性干預(yù)組(A組)：在無血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。3.共培養(yǎng)組(B組)：在無血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后,更換含有完全培養(yǎng)基同時置入預(yù)先種入BMSCs細(xì)胞的transwell小室,共培養(yǎng)24h,三組實驗都分為2個階段,時間各24h。2.Realtime-PCR:BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細(xì)胞中基因的表達(dá)。采用Realtime-PCR檢測三組獲得NP細(xì)胞的ADAMTS-4、5、7,MMP-3、13,TIMP-1的基因相對表達(dá)量。3.細(xì)胞凋亡的檢測：根據(jù)beyotime提供的Caspase-3活性檢測試劑盒說明書,對于三組細(xì)胞CASPASE-3的活性進(jìn)行檢測。同時還對于三組細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色,觀察三組細(xì)胞的TUNEL染色的活性,進(jìn)行比較。BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細(xì)胞凋亡比例變化。取各組NP細(xì)胞,使用Annexin V (PE)/PI流式試劑盒檢測凋亡的變化。在流式檢測中,加入直接共培養(yǎng)(C組),使用相同數(shù)量的GFP-BMSCs直接加入炎性因子損失的NP細(xì)胞中,觀察四組髓核細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化。4.細(xì)胞遷徙的檢測：對于Ong/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml濃度的IL-1β干預(yù)髓核細(xì)胞24h,將transwell板由換成8-μm孔徑的濾板,通過四組的比較,觀察BMSCs對于炎性損傷的NP細(xì)胞的遷徙能力。5.線粒體染色現(xiàn)象觀察：使用24孔提前鋪片,使用IL-1β(20ng/ml)干預(yù)NP細(xì)胞24h之后,加入使用帶有GFP熒光的BMSCs, GFP-BMSCs使用線粒體染料預(yù)染色,直接接觸共培養(yǎng)24h后,將細(xì)胞玻片取出在共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果：1.NP細(xì)胞、BMSCs純度鑒定。BMSCs傳至第3代通過流式細(xì)胞儀通過CD29、 CD31、CD45、CD90位點鑒定細(xì)胞純度,BMSCs的流式鑒定結(jié)果顯示90%以上的BMSCs表現(xiàn)為CD29,CD90陽性,小于5%的BMSCs的CD31及CD45陽性,細(xì)胞純度較好。髓核細(xì)胞免疫組化顯示的二型膠原表達(dá)較好,符合NP細(xì)胞的膠原表達(dá)特點。2.Realtime-PCR結(jié)果,相比于對照組,A組中ADAMTS-4,ADAMTS-5, ADAMTS-7,MMP-13,MMP-3表達(dá)顯著升高,五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。而相比A組,B組各項退變指標(biāo)基因表達(dá)量顯著降低,五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。3.細(xì)胞凋亡檢測：三組細(xì)胞TUNEL染色顯示炎性刺激組(A組)髓核細(xì)胞凋亡明顯增加,BMSCs共培養(yǎng)組(B組)對于炎性因子導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞的數(shù)量的增產(chǎn)生有效的抑制。在Caspase-3的檢測中,A組比較對照組caspase-3活性升高明顯,二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而相比于A組,B組中Caspase-3活性下降,二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。Annexin V (PE)/PI流式結(jié)果,與對照組相比,A組NP細(xì)胞在炎性因子刺激下凋亡增加明顯,二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。經(jīng)過BMSCs間接共同培養(yǎng)(B組)后,相比于A組,NP細(xì)胞凋亡下降明顯,二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。Annexin V(PE)/PI流式結(jié)果中,直接共培養(yǎng)的結(jié)果(C組)和間接共培養(yǎng)組(B組)對凋亡都有抑制作用,但兩者無統(tǒng)計學(xué)差異。4.BMSCs遷徙結(jié)果：通過考馬斯亮藍(lán)染色后BMSCs細(xì)胞數(shù)量的比較,可以發(fā)現(xiàn),IL-1β濃度的不斷升高,即隨著炎性因子對于髓核細(xì)胞損傷的程度不斷增加,BMSCs對于髓核細(xì)胞的遷徙能力不斷增強(qiáng)。四組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。5.線粒體一體化結(jié)果：從圖可以看出GFP-BMSCs可以通過隧道納米管,將線粒體傳輸進(jìn)炎性損傷的NP細(xì)胞內(nèi),完成細(xì)胞之間的直接營養(yǎng)作用。結(jié)論：BMSCs可通過旁分泌的方式,有效降低炎性所致的NP細(xì)胞退變和凋亡的比例,說明BMSCs作為種子細(xì)胞在椎間盤退行性病變的治療中,對于椎間盤炎性環(huán)境的“治療”作用不可忽視。同時BMSCs可以炎性損傷的NP細(xì)胞進(jìn)行遷移,說明BMSCs可以在椎間盤內(nèi)炎性內(nèi)環(huán)境嚴(yán)重的部位遷徙,發(fā)揮治療作用,以及我們觀察到在直接共培養(yǎng)的時候,BMSCs可以通過隧道納米管,向損傷的NP細(xì)胞傳輸線粒體,通過本實驗的設(shè)計可以一定程度上模擬體內(nèi)干細(xì)胞治療過程,為更準(zhǔn)確的研究干細(xì)胞治療機(jī)制提供條件。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 牛濤;陳伯華;胡有谷;;TRAIL在正常椎間盤細(xì)胞中的分布及表達(dá)[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2007年03期

2 王娜;田偉;趙丹慧;;基因治療椎間盤退變的實驗研究[J];國際骨科學(xué)雜志;2007年06期

3 孫建華;鄭啟新;;椎間盤組織工程種子細(xì)胞及細(xì)胞支架研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2010年01期

4 張琦;錢濟(jì)先;;細(xì)胞移植治療椎間盤退行性變研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2010年01期

5 劉少強(qiáng);齊強(qiáng);陳仲強(qiáng);;Modic改變分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2012年06期

6 劉林;駱文遠(yuǎn);張超;宋玉鑫;舍煒;;兔退變椎間盤纖維環(huán)及髓核組織中的PG、MMP-3、TIMP-2表達(dá)變化及意義[J];重慶醫(yī)學(xué);2014年17期

7 沈英英;林圣云;;間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療再生障礙性貧血研究進(jìn)展[J];甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2015年03期

8 王小虎;吳小濤;;椎間盤退變機(jī)制的研究概況[J];東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年05期

9 丁曉明;徐寶山;伍耀宏;許海委;楊強(qiáng);馬信龍;張春秋;李秀蘭;張揚(yáng);;PKH26熒光標(biāo)記牛尾髓核細(xì)胞的實驗研究[J];天津醫(yī)藥;2014年09期

10 謝光友;呂富榮;楊海濤;;干細(xì)胞治療退變椎間盤組織再生的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2014年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張麗;hTERT基因修飾的椎間盤髓核細(xì)胞永生化研究及干細(xì)胞樣髓核細(xì)胞的分離鑒定[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 張彥男;脊索細(xì)胞體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化及聯(lián)合性移植阻止兔椎間盤退行性變的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2011年

3 權(quán)學(xué)民;益氣化瘀中藥結(jié)合BMSCs移植干預(yù)腰椎間盤退變的實驗研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

4 莊穎;組織工程椎間盤的體外初步構(gòu)建及其生物學(xué)性能研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

5 王海強(qiáng);MicroRNA-155調(diào)控在人椎間盤退變中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

6 張彥男;脊索細(xì)胞體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化及聯(lián)合移植阻止兔椎間盤退行性變的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2011年

7 高鋒;低強(qiáng)度脈沖超聲波促進(jìn)人髓核細(xì)胞合成胞外基質(zhì)功能性成分的體外實驗研究[D];蘇州大學(xué);2011年

8 李喜功;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞體外共培養(yǎng)的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2011年

9 李雄;雙節(jié)段頸人工椎間盤置換對下位椎間隙內(nèi)壓力影響的生物力學(xué)實驗和臨床研究[D];中南大學(xué);2007年

10 夏數(shù)數(shù);rhTGF-β_1與手法對兔頸椎間盤早期退變延緩作用及其機(jī)理研究[D];湖北中醫(yī)學(xué)院;2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李進(jìn)珍;AMSCs復(fù)合殼聚糖復(fù)合支架移植對兔退變早期椎間盤內(nèi)TNF-α、IL-1β的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 徐遠(yuǎn);大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞體外共培養(yǎng)的實驗研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

3 汪代東;GSH對H_2O_2誘導(dǎo)人髓核細(xì)胞死亡與基質(zhì)破壞的保護(hù)作用[D];暨南大學(xué);2011年

4 陳清河;組織工程髓核移植治療椎間盤退變的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

5 余小勇;SA-β-Gal引起腰椎軟骨終板退變機(jī)制的實驗研究[D];南昌大學(xué);2011年

6 高希武;塞來昔布對大鼠腰椎間盤髓核退變影響的實驗研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2010年

7 張琦;SOX9基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)BMSCs分化為類髓核細(xì)胞[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

8 周建國;一氧化氮對兔纖維環(huán)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];華中科技大學(xué);2010年

9 高春生;脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞定向分化的分子機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2011年

10 張勇;GDF-5與兔椎間盤體外模型聯(lián)合誘導(dǎo)兔BMSCs向類髓核細(xì)胞分化的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2011年

，

本文編號：2552328