【摘要】：第一部分卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變模型的研究目的：對(duì)卵巢切除大鼠進(jìn)行脊柱融合手術(shù),觀察脊柱融合術(shù)后相鄰節(jié)段椎間盤退變情況,探討脊柱融合術(shù)后相鄰節(jié)段椎間盤的退變情況和病理特點(diǎn)以及骨質(zhì)疏松對(duì)相鄰節(jié)段椎間盤退變的影響。方法：40只雌性3月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠分為以下4組:Sham組(假手術(shù)組),OVX組(卵巢切除組),PLF組(脊柱融合手術(shù)組)以及OVX+PLF組(卵巢切除+脊柱融合手術(shù))。在大鼠3月齡時(shí)進(jìn)行OVX手術(shù),4周后再行脊柱融合手術(shù)。對(duì)L4-5節(jié)段進(jìn)行雙側(cè)脊柱融合手術(shù)并取自體髂骨研磨進(jìn)行骨移植以及棘突鋼絲環(huán)形纏繞。脊柱融合后12周,先進(jìn)行X-ray掃描觀察融合情況并進(jìn)行影像學(xué)評(píng)分,再處死動(dòng)物取出L3-6節(jié)段及其椎間盤。采用手法評(píng)估判斷融合情況,分離L5-6椎間盤及相鄰椎體,進(jìn)行脫鈣、包埋、切片以及染色。對(duì)L5-6椎間盤進(jìn)行van Gieson染色觀察相鄰節(jié)段椎間盤退變情況并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。結(jié)果：1融合情況評(píng)估影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組相比,X-ray檢測(cè)顯示OVX和OVX+PLF組大鼠脊柱的影像學(xué)密度以及椎間盤高度降低。與PLF組相比,OVX+PLF組大鼠融合部位面積較小。PLF組的影像學(xué)評(píng)分為3.00±0.92,OVX+PLF組的影像學(xué)評(píng)分則為2.15±0.88。OVX+PLF組明顯低于PLF組(P0.05)。Sham與OVX組無(wú)手術(shù)故無(wú)融合。手法檢測(cè)結(jié)果:對(duì)進(jìn)行PLF手術(shù)的大鼠(PLF和OVX+PLF組)進(jìn)行手法檢查,發(fā)現(xiàn)棘突纏繞的鋼絲完整且固定良好。所有進(jìn)行PLF的大鼠均未檢測(cè)到融合節(jié)段的活動(dòng)。2椎間盤退變情況PLF和OVX+PLF組大鼠可見終板鈣化增加,髓核細(xì)胞減少并且部分已向軟骨細(xì)胞方向化生,并有粘液樣變性,纖維環(huán)排列紊亂。且OVX+PLF組的椎間盤退變程度高于PLF組。組織學(xué)評(píng)分顯示,Sham組為1.21±0.45,OVX組為3.20±0.45,PLF組為3.01±0.71,OVX+PLF組5.41±1.14。PLF組明顯高于Sham組(P0.05),且OVX+PLF組明顯高于PLF組(P0.05)。結(jié)論：采用脊柱融合手術(shù)以及棘突鋼絲固定可使鄰近節(jié)段椎間盤發(fā)生退變,且在骨質(zhì)疏松的情況下鄰近節(jié)段椎間盤退變更加嚴(yán)重。在臨床和大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,相鄰節(jié)段椎間盤退變的發(fā)展時(shí)間較長(zhǎng),從而限制了其研究,而本實(shí)驗(yàn)采用大鼠模型進(jìn)行試驗(yàn),不僅經(jīng)濟(jì)可靠,且可以快速造模、縮短實(shí)驗(yàn)周期,對(duì)闡述相鄰節(jié)段椎間盤退變的病理過程以及使用藥物干預(yù)治療提供了良好的模型。第二部分阿侖膦酸鈉對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的潛在保護(hù)作用探討阿侖膦酸鈉(Alendronate,ALN)對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的作用。方法：50只雌性3月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠分為以下5組:Sham+V組(假手術(shù)組),OVX+V組(卵巢切除組),PLF+V組(脊柱融合手術(shù)組),OVX+PLF+V組(卵巢切除+脊柱融合手術(shù))以及OVX+PLF+ALN組(卵巢切除+脊柱融合手術(shù)+皮下注射ALN)。Sham組僅切開皮膚暴露卵巢但不切除。在大鼠3月齡時(shí)進(jìn)行OVX手術(shù),4周后再行脊柱融合手術(shù)。對(duì)雙側(cè)L4-5節(jié)段進(jìn)行雙側(cè)脊柱融合手術(shù)并取自體髂骨研磨進(jìn)行骨移植以及棘突鋼絲環(huán)形纏繞。OVX+PLF+ALN組脊柱融合后即開始皮下注射ALN,劑量為70μg/Kg·W,每周一次。Sham、OVX、PLF及OVX+PLF組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對(duì)照。脊柱融合后12周,處死動(dòng)物并取出L3-6節(jié)段及其椎間盤,同時(shí)采血2m L,置于-80℃保存用于骨代謝標(biāo)記物檢測(cè)。先采用手法評(píng)估判斷融合情況,再磨鉆分離雙側(cè)L4-5橫突間融合部位并分離L5-6椎間盤及相鄰椎體,進(jìn)行脫2椎間盤退變情況鈣、包埋、切片以及染色。對(duì)融合部位采用HE染色觀察新成骨情況并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。對(duì)L5-6椎間盤進(jìn)行van Gieson染色觀察相鄰節(jié)段椎間盤退變情況并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。同時(shí),基于VG染色圖像測(cè)量對(duì)椎間盤高度、終板厚度及終板鈣化面積比等進(jìn)行測(cè)量,且均。結(jié)果1融合情況評(píng)估組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果:PLF+V和OVX+PLF+V組大鼠L4-5橫突間為不規(guī)則編制骨,有骨樣基質(zhì)形成,其間有軟骨樣及成纖維樣組織形成,尚有小部分死骨存在。而OVX+PLF+V組大鼠融合部位骨形成程度不及PLF+V組。OVX+PLF+ALN組大鼠融合部位表現(xiàn)出相互交聯(lián)的骨小梁以及之間的骨髓。PLF+V組的組織學(xué)評(píng)分為3.60±1.00,OVX+PLF+V組的組織學(xué)評(píng)分為3.21±1.21,OVX+PLF+ALN組的組織學(xué)評(píng)分為5.34±1.40。OVX+PLF+ALN組的組織學(xué)評(píng)分明顯高于OVX+PLF+V組(P0.05)。Sham與OVX組無(wú)手術(shù)故無(wú)融合。手法檢測(cè)結(jié)果:對(duì)進(jìn)行PLF+V手術(shù)的大鼠(PLF+V、OVX+PLF+V和OVX+PLF+ALN組)檢查發(fā)現(xiàn)棘突纏繞的鋼絲完整且固定良好。所有進(jìn)行PLF的大鼠均未檢測(cè)到融合節(jié)段的活動(dòng)。2椎間盤退變情況PLF+V和OVX+PLF+V組大鼠可見終板鈣化增加,髓核細(xì)胞減少并且部分已向軟骨細(xì)胞方向化生,并有粘液樣變性,纖維環(huán)排列紊亂。且OVX+PLF+V組的椎間盤退變程度要高于PLF+V組。OVX+PLF+ALN組的髓核內(nèi)僅有少量軟骨樣細(xì)胞,未見有粘液性變性,其退變程度較輕。組織學(xué)評(píng)分顯示,Sham+V組為1.21±0.45,OVX+V組為3.20±0.45,PLF+V組為3.01±0.71,OVX+PLF+V組5.41±1.14。PLF+V組明顯高于Sham+V組(P0.05),且OVX+PLF+V組明顯高于PLF+V組(P0.05)。且OVX+PLF+ALN組要明顯低于OVX+PLF+V組(P0.05)。3參數(shù)測(cè)量結(jié)果OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組椎間盤高度明顯低于Sham+V組(P0.05),而終板厚度和終板鈣化面積比率明顯高于Sham+V組(P0.05)。然而,經(jīng)ALN干預(yù)12周后,OVX+PLF+ALN組大鼠椎間盤高度顯著高于OVX+PLF+V組(P0.05),而終板厚度和終板鈣化面積比率顯著低于OVX+PLF+V組(P0.05)。4血清骨代謝標(biāo)記物ELISA分析與Sham+V組相比,OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組的血清OC水平明顯下降(P0.05),CTX-I明顯升高(P0.05)。而O VX+PLF+ALN組血清OC水平明顯高于OVX+PLF+V組(P0.05),CTX-I明顯低于OVX+PLF+V組(P0.05)。結(jié)論：在卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變模型中,早期皮下注射ALN能夠延緩相鄰節(jié)段椎間盤退變。ALN是一種緩解椎間盤退變的潛在性藥物,本實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。第三部分阿侖膦酸鈉延緩大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的作用目的：ALN可以延緩鄰近節(jié)段椎間盤退變,但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚未得到闡述。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變模型,早期皮下注射ALN進(jìn)行干預(yù),觀察ALN對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的影響,并初步分析其作用機(jī)制。方法：50只雌性3月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠分為以下5組:Sham+V組(假手術(shù)組),OVX+V組(卵巢切除組),PLF+V組(脊柱融合手術(shù)組),OVX+PLF+V組(卵巢切除+脊柱融合手術(shù))以及OVX+PLF+ALN組(卵巢切除+脊柱融合手術(shù)+皮下注射ALN)。Sham組僅切開皮膚暴露卵巢但不切除。在大鼠3月齡時(shí)進(jìn)行OVX手術(shù),4周后再行脊柱融合手術(shù)。對(duì)雙側(cè)L4-5節(jié)段進(jìn)行雙側(cè)脊柱融合手術(shù)并取自體髂骨研磨進(jìn)行骨移植以及棘突鋼絲環(huán)形纏繞。OVX+PLF+ALN組脊柱融合后開始皮下注射ALN,劑量為70μg/Kg·W,每周一次。Sham+V、OVX+V、PLF+V及OVX+PLF+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對(duì)照。脊柱融合后12周,進(jìn)行X-ray掃描觀察融合情況并進(jìn)行影像學(xué)評(píng)分,之后處死動(dòng)物并取出L3-6節(jié)段及其椎間盤。采用手法評(píng)估判斷融合情況,之后使用磨鉆分離雙側(cè)L4-5橫突間融合部位以及L5-6椎間盤及相鄰椎體,進(jìn)行脫鈣、包埋、切片以及染色。對(duì)融合部位采用HE染色觀察新成骨情況并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。L6椎體的BMD及微結(jié)構(gòu)分別采用雙能X線及Micro-CT測(cè)量對(duì)L5-6椎間盤進(jìn)行van Gieson染色觀察相鄰節(jié)段椎間盤退變情況并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。同時(shí),對(duì)微血管密度以及微血管面積比等進(jìn)行測(cè)量,且均基于VG染色圖像。免疫組織化學(xué)染色及real-time PCR用于檢測(cè)各組大鼠椎間盤中aggrecan、I型膠原、II型膠原、MMP-13及ADAMTS-4表達(dá)的變化。3D運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)用于相鄰節(jié)段L5-6椎間盤的6自由度的檢測(cè)。結(jié)果：1融合情況評(píng)估手法檢測(cè)結(jié)果:對(duì)進(jìn)行PLF手術(shù)的大鼠(PLF+V,OVX+PLF+V和OVX+PLF+ALN組)檢查發(fā)現(xiàn)棘突纏繞的鋼絲完整且固定良好。所有進(jìn)行PLF的大鼠未檢測(cè)到融合節(jié)段的活動(dòng)。2 L6椎體的BMD以及Micro-CT結(jié)果OVX+V組和OVX+PLF+V組大鼠L6椎體的BMD均明顯低于Sham+V組(P0.05)。OVX+PLF+ALN組大鼠L6椎體的BMD明顯高于OVX+PLF+V組(P0.05)。OVX+V組和OVX+PLF+V組大鼠L6椎體的BV/TV、Tb.N及Tb.Th均顯著低于Sham+V組(P0.05),而Tb.Sp及SMI則顯著高于Sham+V組(P0.05)。OVX+PLF+ALN組椎體BV/TV、Tb.N及Tb.Th顯著高于OVX+PLF+V組(P0.05),Tb.Sp及SMI則顯著低于OVX+V組(P0.05)。3椎間盤退變的組織學(xué)分析及評(píng)分OVX+V、PLF+V和OVX+PLF+V組大鼠可見終板鈣化增加,髓核細(xì)胞減少并且部分已向軟骨細(xì)胞方向化生,并有粘液樣變性,纖維環(huán)排列紊亂。且OVX+PLF+V組的椎間盤退變程度高于PLF組(P0.05)。OVX+PLF+ALN組的髓核內(nèi)僅有少量軟骨樣細(xì)胞,未見有粘液性變,其退變較輕。組織學(xué)評(píng)分顯示,Sham+V組為1.21±0.45,OVX+V組為3.20±0.45,PLF+V組為3.01±0.71,OVX+PLF+V組5.41±1.14。PLF+V組明顯高于Sham+V組(P0.05),且OVX+PLF+V組明顯高于PLF+V組(P0.05)。而OVX+PLF+ALN組要明顯低于OVX+PLF+V組(P0.05)。4參數(shù)測(cè)量結(jié)果OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組微血管數(shù)量以及微血管面積明顯低于Sham+V組(P0.05)。然而,經(jīng)ALN干預(yù)12周后,OVX+PLF+ALN組大鼠微血管數(shù)量以及微血管面積顯著高于OVX+PLF+V組(P0.05)。5椎間盤退變的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及IOD值分析在髓核內(nèi),OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組部分髓核被軟骨樣細(xì)胞代替,其MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I表達(dá)增高,Col-II、Aggrecan表達(dá)則降低。MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明顯高于Sham+V組(P0.05),而Col-II、Aggrecan明顯低于Sham+V組(P0.05)。而OVX+PLF+ALN組MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I顯著低于OVX+PLF+V組(P0.05),Col-II、Aggrecan表達(dá)則顯著高于OVX+PLF+V組(P0.05),MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明顯低于OVX+PLF+V組(P0.05),而Col-II、Aggrecan明顯高于OVX+PLF+V組(P0.05)。在纖維環(huán)內(nèi),OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組纖維環(huán)排列較紊亂,其MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I表達(dá)增高,Col-II、Aggrecan表達(dá)則降低。MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明顯高于Sham+V組(P0.05),而Col-II、Aggrecan明顯低于Sham+V組(P0.05)。而OVX+PLF+ALN組MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I顯著低于OVX+PLF+V組(P0.05),Col-II、Aggrecan表達(dá)則顯著高于OVX+PLF+V組(P0.05),MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明顯低于OVX+PLF+V組(P0.05),而Col-II、Aggrecan明顯高于OVX+PLF+V組(P0.05)。6 Real-time PCR結(jié)果分析對(duì)L3-4椎間盤進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)顯示,OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組Col2α1和Aggrecan明顯低于Sham+V組(P0.05),而Col1α1、MMP-13以及ADAMTS-4明顯高于Sham+V組(P0.05)。給予ALN干預(yù)12周后,OVX+PLF+ALN組Col2α1和Aggrecan明顯高于OVX+PLF+V組(P0.05),而Col1α1、MMP-13以及ADAMTS-4明顯低于OVX+PLF+V組(P0.05)。7 3D運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)結(jié)果在前屈、左右旋轉(zhuǎn)以及左右側(cè)彎的加載中,PLF+V組、OVX+PLF+V組以及OVX+PLF+ALN組L5-6節(jié)段之間運(yùn)動(dòng)范圍均較Sham+V組減少(P0.05)。三組之間無(wú)差別。結(jié)論：1骨質(zhì)疏松加重相鄰節(jié)段椎間盤退變,提示骨質(zhì)疏松是脊柱融合術(shù)后相鄰節(jié)段椎間盤退變的危險(xiǎn)因素。2早期給予ALN干預(yù)可有效緩解卵巢切除大鼠相鄰節(jié)段椎間盤退變的進(jìn)程。其可能與維持椎體骨密度以及微結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性,并可以增加終板血管數(shù)量及面積,保護(hù)椎間盤營(yíng)養(yǎng)通路。同時(shí),ALN可以調(diào)節(jié)椎間盤基質(zhì)的代謝平衡,幫助維持椎間盤的完整和功能。3 ALN可以認(rèn)為是一種能夠緩解骨質(zhì)疏松狀態(tài)下脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的潛在性藥物。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R687.3

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6 尹小鋒;皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞復(fù)合異種脫蛋白骨應(yīng)用于脊柱融合的實(shí)驗(yàn)研究[D];南昌大學(xué);2010年

7 胡明濤;金屬植入物及Ⅰ型膠原蛋白基因多態(tài)性與自體骨移植后脊柱融合效果的相關(guān)性[D];青島大學(xué);2010年

8 吳貴忠;凝膠型E基質(zhì)在大鼠脊柱后外側(cè)融合中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2009年

9 劉尊鵬;纖維蛋白凝膠復(fù)合rhBMP2及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于兔脊柱融合的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2005年

10 高偉;帶蒂脂肪組織復(fù)合rhBMP-2應(yīng)用于兔脊柱融合的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2007年

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