【摘要】：背景與目的結(jié)蛋白基因突變導(dǎo)致的結(jié)蛋白病是一種遺傳性蛋白聚集性肌病,線粒體異常是結(jié)蛋白病最早發(fā)生的病理改變之一,然而導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)異常的相關(guān)機制目前不完全清楚。膜孔通道蛋白1/電壓依賴陰離子通道1(VDAC1)是線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔(mPTP)的重要調(diào)控亞基,當(dāng)mPTP通透性增高時,大量細胞凋亡因子從線粒體膜間隙釋放到胞漿,導(dǎo)致細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。然而結(jié)蛋白病與VDAC1是否有明確關(guān)系尚無研究明確闡述,本研究通過免疫組化觀察結(jié)蛋白沉積性肌病患者和結(jié)蛋白病動物模型中VDAC1及其相關(guān)凋亡蛋白(Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)的表達,探究結(jié)蛋白病肌細胞內(nèi)線粒體異常的可能機制。方法1.構(gòu)建腺病毒包裝的突變型和野生型結(jié)蛋白基因的真核生物表達質(zhì)粒。2.首次造模:實驗組將濃度為1.0×1011pfu/ml包裝有突變型結(jié)蛋白質(zhì)粒的腺病毒按九宮格法分九點微量注射到28-35日齡雄性SD大鼠左后大腿肌內(nèi),每只大鼠注射總量為100μl。右后大腿對應(yīng)點注射等量包裝有野生型結(jié)蛋白基因質(zhì)粒的腺病毒為對照組。分別于轉(zhuǎn)染后第2、7、14、21、28天各處死2只大鼠,取注射點處的肌肉行肌肉冰凍切片常規(guī)染色及desmin免疫組化染色。對比觀察出現(xiàn)以結(jié)蛋白沉積為主要改變的典型結(jié)蛋白病病理改變的轉(zhuǎn)染后天數(shù),以確定造模條件。3.重復(fù)造模:根據(jù)上述的實驗結(jié)果,將突變結(jié)蛋白基因的腺病毒微量注射4只28-35日齡雄性SD大鼠(方法同上),在已觀察到的出現(xiàn)以結(jié)蛋白沉積為主要改變的轉(zhuǎn)染后天數(shù)取注射區(qū)局部肌肉,行冰凍切片desmin免疫組化染色,觀察模型的穩(wěn)定性。4.將造模成功動物模型與結(jié)蛋白沉積性肌病患者骨骼肌行常規(guī)病理及免疫熒光雙標(biāo)染色,對比觀察VDAC1及其相關(guān)凋亡蛋白(Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)的表達。結(jié)果1.首次造模發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后第14天,2只SD大鼠實驗組的轉(zhuǎn)染局部肌肉的肌纖維內(nèi)均出現(xiàn)結(jié)蛋白沉積等典型結(jié)蛋白病病理改變;取4只SD大鼠重復(fù)造模,在轉(zhuǎn)染后第14天觀察到有3只大鼠實驗組轉(zhuǎn)染局部肌肉的肌纖維內(nèi)出現(xiàn)結(jié)蛋白沉積等典型結(jié)蛋白病病理改變。2.結(jié)蛋白沉積性肌病患者與結(jié)蛋白病動物模型均在結(jié)蛋白沉積的肌纖維內(nèi)出現(xiàn)VDAC1、促凋亡蛋白(Bax、ATF2)聚集高信號,而抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)無聚集。其中結(jié)蛋白沉積性肌病患者的結(jié)蛋白沉積肌纖維內(nèi)Bcl-2、Bcl-xl較正常肌纖維信號無明顯變化,HKⅡ較正常信號略低;結(jié)蛋白病動物模型的結(jié)蛋白沉積肌纖維內(nèi)Bcl-2較正常信號略低,Bcl-xl、HKⅡ較正常肌纖維信號無明顯變化。結(jié)論1.我們以腺病毒包被突變結(jié)蛋白基因以直接肌肉注射轉(zhuǎn)染方式成功構(gòu)建出結(jié)蛋白病動物模型,驗證模型穩(wěn)定性高。2.結(jié)蛋白病的發(fā)生可能與線粒體相關(guān)性促凋亡蛋白(Bax、ATF2)的活化,抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)的表達,刺激VDAC1開放、高表達,進而誘導(dǎo)凋亡因子從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì),導(dǎo)致細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。
【圖文】：

第 2章 材料與方法則取消第 3 次注射；如未達到麻醉效果則繼續(xù)注射。注射完麻醉藥物后，輕微旋轉(zhuǎn)拔出針頭，防止漏液[25]。麻醉成功后，雙后大腿備皮，用記號筆在雙后大腿皮膚畫九宮格，每小格長度約 0.3cm×0.3cm（圖 1）。用碘伏消毒局部后，實驗組取左后大腿用微量注射器行肌肉微量注射濃度為 1.0×1011pfu/ml 包被突變 desmin 基因的腺病毒液（rAd5-DES-L274P），每只大鼠注射總量為 100μl，按九宮格平均分為 9 點注射。相對應(yīng)部位的右大腿肌肉注射等量包被野生型 desmin 基因的腺病毒液（rAd5-DES-wild）為對照組。

圖 2：轉(zhuǎn)染后大鼠在轉(zhuǎn)輪中自由奔跑。2.2.3 實驗標(biāo)本的取材及后處理(1).分別于轉(zhuǎn)染后第 2 天、7 天、14 天、21 天、28 天各斷頸處死 2 只。(2).注射局部備皮后用組織剪剪開雙后大腿注射點局部皮膚，取注射處肌黃耆樹膠固定于軟塞，避免傾倒。(3).在 100ml 長柄量勺中倒入 70-80ml 異戊烷。(4).裝有異戊烷的量勺放入液氮中。(5).大鑷子攪動異戊烷，使異戊烷充分冷卻。(6).大鑷子夾住標(biāo)本，將標(biāo)本放于液態(tài)異戊烷中輕微晃動，降溫 20 秒。(7).凍結(jié)好的標(biāo)本放于-80℃冰箱保存，以備做后期的冰凍切片和免疫。(8).組織經(jīng)免疫組化染色觀察，選擇出現(xiàn)典型結(jié)蛋白病病理改變的時間點
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R685

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本文編號：2537538