【摘要】：椎間盤退變是導(dǎo)致脊柱退行性病變的重要病理學(xué)基礎(chǔ),其相關(guān)并發(fā)癥可引起椎間盤突出,椎管狹窄,椎體滑脫、脊柱不穩(wěn)、脊柱側(cè)彎等脊柱疾患,影響我國國民健康和生活質(zhì)量。在正常人體椎間盤中,存在多個重要的生理穩(wěn)態(tài),主要包括免疫穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)及氧穩(wěn)態(tài)等。它們之間相互聯(lián)系,密切相關(guān)。同時,它們也在不同的年齡階段保持動態(tài)的生理平衡。這些穩(wěn)態(tài)的維持是保證椎間盤正常生理功能的重要條件和基礎(chǔ)。當(dāng)穩(wěn)態(tài)因不同的內(nèi)因或外因被打破時,椎間盤退變的進(jìn)程便悄然開始;與此同時,椎間盤的病理發(fā)展也會加快各穩(wěn)態(tài)失衡。目前對于椎間盤退變機(jī)制的研究,究其根本多是圍繞其穩(wěn)態(tài)失衡這一核心展開;而對于椎間盤退變的治療和椎間盤再生,通過生物材料、干細(xì)胞及刺激因子等各種途徑進(jìn)行穩(wěn)態(tài)重構(gòu)和維持是恢復(fù)椎間盤正常功能的重要前提基礎(chǔ)。本研究旨在針對椎間盤中存在的多個重要生理穩(wěn)態(tài),分別從不同角度對椎間盤的免疫穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)及氧穩(wěn)態(tài)進(jìn)行椎間盤退變機(jī)制的研究分析,并通過應(yīng)用生物材料和脂肪干細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)態(tài)的干預(yù)和重構(gòu),圍繞穩(wěn)態(tài)這一核心,對椎間盤退變和再生機(jī)制進(jìn)行深入研究。整個研究分為以下四個部分(其中第四部分包括三個實(shí)驗(yàn))。第一部分椎間盤免疫穩(wěn)態(tài)中Fas L對維持無血管化的作用研究實(shí)驗(yàn)背景及目的:椎間盤是人體最大的無血管器官,血管浸潤帶來的免疫細(xì)胞和炎性介質(zhì)可引起椎間盤內(nèi)部免疫穩(wěn)態(tài)失衡。Fas L為II型跨膜蛋白,當(dāng)Fas L與其配體Fas結(jié)合后,可激活表達(dá)有Fas細(xì)胞的下游凋亡通路,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。資料顯示Fas L在正常椎間盤髓核細(xì)胞中具有陽性表達(dá),同時血管內(nèi)皮細(xì)胞有Fas陽性表達(dá)。因此,該部分旨在觀察髓核細(xì)胞Fas L對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用影響,研究Fas L對椎間盤維持無血管化的分子機(jī)制,探討其對椎間盤免疫穩(wěn)態(tài)維持的作用影響。方法:分別獲得人椎間盤髓核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HMEC-1細(xì)胞),構(gòu)建慢病毒上調(diào)人髓核細(xì)胞Fas L表達(dá),ELISA檢測髓核細(xì)胞培養(yǎng)液中可溶性Fas L(s Fas L)的表達(dá)水平。建立髓核細(xì)胞與HMEC-1細(xì)胞的非接觸共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)48h后消化收集細(xì)胞,對共培養(yǎng)后HMEC-1細(xì)胞進(jìn)行流式凋亡檢測,同時檢測其Fas及相關(guān)凋亡通路的表達(dá)。結(jié)果:在髓核細(xì)胞的培養(yǎng)液中存在s Fas L表達(dá),其濃度隨椎間盤退變表達(dá)降低。通過慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)Fas L的髓核細(xì)培養(yǎng)液中的s Fas L表達(dá)水平高于無病毒轉(zhuǎn)染組。HMEC-1細(xì)胞的凋亡率在正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)組明顯高于退變髓核細(xì)胞共培養(yǎng)組。在上調(diào)髓核細(xì)胞Fas L表達(dá)后,髓核細(xì)胞可誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞凋亡率增高。同時,HMEC-1細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后,細(xì)胞中的Fas表達(dá)、相關(guān)凋亡通路FADD和Caspase-3表達(dá)也升高。結(jié)論:椎間盤髓核細(xì)胞表達(dá)的Fas L可誘導(dǎo)血管內(nèi)盤細(xì)胞凋亡,在抑制血管浸潤、阻斷免疫細(xì)胞進(jìn)入椎間盤發(fā)揮潛在功能。這些結(jié)果提示Fas L在維持椎間盤的免疫穩(wěn)態(tài)中的重要作用。第二部分椎間盤細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中CK8在髓核細(xì)胞中的表型與降解機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)背景及目的:角蛋白8(Cytokeratin 8,CK8)是角蛋白家族的重要一員,在細(xì)胞維持正常結(jié)構(gòu)和形狀、對生物力自體保護(hù)、蛋白分泌及細(xì)胞凋亡等多方面發(fā)揮重要作用。然而,目前研究對于CK8在髓核細(xì)胞中的表型及在退變髓核中的降解機(jī)制仍不明確,鑒于CK8表達(dá)及磷酸化與生物力學(xué)緊密相關(guān),我們設(shè)想其在髓核細(xì)胞中的表達(dá)也受到壓力影響。因此,本實(shí)驗(yàn)通過將髓核細(xì)胞置于高壓培養(yǎng)環(huán)境,觀察壓力對其磷酸化和降解的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法:首先,獲得人椎間盤髓核組織,應(yīng)用Western blot和免疫熒光檢測CK8與磷酸化CK8在髓核中的表達(dá)。然后,獲得并培養(yǎng)髓核細(xì)胞,將其分別置于3.0Mpa下培養(yǎng)4h,24h和48h,或于0.3Mpa,1.0Mpa及3.0Mpa下培養(yǎng)48h。應(yīng)用Western blot和免疫共沉淀反應(yīng)檢測壓力培養(yǎng)后髓核細(xì)胞CK8的磷酸化表達(dá)及其可溶性表達(dá)水平與壓力培養(yǎng)時間和強(qiáng)度的相關(guān)性。同時,通過應(yīng)用蛋白激酶C(PKC)激活劑和抑制劑進(jìn)行髓核細(xì)胞PKC活性與CK8磷酸化關(guān)系的檢測。結(jié)果:CK8在正常髓核細(xì)胞中的表達(dá)高于退變髓核細(xì)胞;而磷酸化CK8在退變髓核細(xì)胞中表達(dá)高于正常髓核細(xì)胞。髓核細(xì)胞CK8的磷酸化水平與可溶性形式隨培養(yǎng)壓力強(qiáng)度增加和時間延長表達(dá)明顯升高。PKC-ε活性隨壓力強(qiáng)度和時間延長升高。在加入PKC激活劑PMA后,髓核細(xì)胞中的CK8表達(dá)降低,而磷酸化表達(dá)升高;加入PKC抑制劑Bis后,高壓培養(yǎng)并未使髓核細(xì)胞中的p CK8表達(dá)升高。結(jié)論:過度壓力可通過誘導(dǎo)CK8降解,破壞髓核細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),對髓核細(xì)胞穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不利影響。而PCK激活和其誘導(dǎo)的CK8磷酸化分解是這一現(xiàn)象的重要機(jī)制。該部分結(jié)果揭示了生物壓力在椎間盤細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中對髓核細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)調(diào)控的分子作用機(jī)制。第三部分全氟三丁胺(PFTBA)在椎間盤氧穩(wěn)態(tài)重構(gòu)中的作用研究實(shí)驗(yàn)背景及目的:研究發(fā)現(xiàn),椎間盤內(nèi)部并不為完全缺氧組織,氧穩(wěn)態(tài)失衡是引發(fā)椎間盤退變的重要原因。因此,特定氧穩(wěn)態(tài)在椎間盤維持正常生理功能中發(fā)揮重要作用。目前,在椎間盤再生的相關(guān)生物材料學(xué)研究中,對于如何維持生物支架內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)穩(wěn)態(tài),特別是氧的穩(wěn)態(tài)仍不明確。PFTBA是應(yīng)用于組織工程學(xué)中常見的供氧載體,其具有安全、無毒、穩(wěn)定釋放氧氣等特點(diǎn)。因此,該部分旨在應(yīng)用PFTBA為氧穩(wěn)態(tài)重構(gòu)的氧濃度調(diào)節(jié)因子,闡明其在椎間盤再生中對髓核細(xì)胞命運(yùn)及功能的影響。方法:制備藻酸鹽凝膠與PFTBA復(fù)合物,分別調(diào)整其PFTBA濃度為2.5%,5%和10%。首先,進(jìn)行物理性質(zhì)的檢測,包括腫脹,分解和氧氣釋放系數(shù)。同時,應(yīng)用掃描電鏡觀察不同濃度PFTBA藻酸鹽凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。之后,在PFTBA藻酸鹽凝膠中復(fù)合人椎間盤髓核細(xì)胞,分別進(jìn)行平面(2D)和三維(3D)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的細(xì)胞中應(yīng)用live/dead染色,CCK-8檢測和細(xì)胞計(jì)數(shù)等檢測分析細(xì)胞在不同濃度PFTBA藻酸鹽中在無氧和常氧環(huán)境中的生存率和增殖情況。應(yīng)用rt-PCR,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測和ELISA檢測分析細(xì)胞外基質(zhì)和髓核標(biāo)記物的表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,建立動物椎間盤退變模型,將含有不同濃度的PFTBA藻酸鹽復(fù)合物注入動物退變椎間盤,在一定時間后分析動物椎間盤的影像學(xué)和組織學(xué)資料,研究和評估其椎間盤狀態(tài)。結(jié)果:PFTBA在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的濃度對藻酸鹽凝膠的物理特性并無顯著影響。藻酸鹽凝膠的氧氣釋放濃度與PFTBA濃度呈正相關(guān)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,PFTBA在無氧環(huán)境中對髓核細(xì)胞的生存和增殖具有不同程度的促進(jìn)作用。同時,含有2.5%PFTBA的藻酸鹽凝膠可在無氧培養(yǎng)中促進(jìn)髓核細(xì)胞合成類似于髓核組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分,且對髓核細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)無明顯作用影響。在體內(nèi)研究中,我們發(fā)現(xiàn)2.5%PFTBA可保護(hù)動物椎間盤高度系數(shù)DHI和相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá),維持椎間盤的正常生理結(jié)構(gòu),對椎間盤退變具有治療作用。結(jié)論:該部分研究在國內(nèi)外首次應(yīng)用PFTBA為氧濃度調(diào)控因子,進(jìn)行椎間盤氧穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)和維持。應(yīng)用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)PFTBA可通過重構(gòu)椎間盤氧穩(wěn)態(tài)促進(jìn)髓核再生,對椎間盤再生的組織工程學(xué)研究具有重要意義。第四部分脂肪干細(xì)胞在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構(gòu)中的作用研究目前,干細(xì)胞在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構(gòu)和組織工程學(xué)中受到了廣泛關(guān)注和研究。其中,脂肪干細(xì)胞由于其取材易、來源廣等優(yōu)點(diǎn),在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構(gòu)和維持中發(fā)揮重要作用。本部分為三個實(shí)驗(yàn),旨在通過脂肪干細(xì)胞與髓核細(xì)胞的共培養(yǎng),重點(diǎn)分析脂肪干細(xì)胞對椎間盤的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)重構(gòu)的重要調(diào)節(jié)作用,同時觀察脂肪干細(xì)胞在椎間盤非生理壓力環(huán)境中的保護(hù)作用,從多角度研究脂肪干細(xì)胞對椎間盤各穩(wěn)態(tài)的重構(gòu)作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)一接觸性共培養(yǎng)對脂肪干細(xì)胞在椎間盤細(xì)胞穩(wěn)態(tài)重構(gòu)的作用研究實(shí)驗(yàn)背景及目的:目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對于人脂肪干細(xì)胞和椎間盤髓核細(xì)胞接觸性共培養(yǎng)方面的研究相對較少。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在通過對脂肪干細(xì)胞與髓核細(xì)胞的接觸性共培養(yǎng),初步研究脂肪干細(xì)胞在椎間盤細(xì)胞穩(wěn)態(tài)重構(gòu)中的作用。方法:分別培養(yǎng)并獲得人脂肪干細(xì)胞和椎間盤髓核細(xì)胞。對獲得的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記物流式細(xì)胞鑒定。通過CFDA熒光標(biāo)記脂肪干細(xì)胞,之后建立脂肪干細(xì)胞和髓核細(xì)胞的接觸性共培養(yǎng)體系。7天后流式分離熒光標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞和無熒光的髓核細(xì)胞,通過rt-PCR分析兩種細(xì)胞的分子變化。結(jié)果:人脂肪干細(xì)胞和髓核細(xì)胞生長良好。流式鑒定顯示脂肪干細(xì)胞標(biāo)記物CD29,CD90等表達(dá)在90%以上。共培養(yǎng)后流式分離兩組細(xì)胞的細(xì)胞純度均高于99%。Rt-PCR顯示共培養(yǎng)后脂肪干細(xì)胞的SOX9,COL2A1,ACAN和COL6A2表達(dá)明顯升高,其髓核細(xì)胞標(biāo)記物FOXF1,PAX1,CA12,和HBB也明顯升高。同時,其相關(guān)生長因子如CDMP-1,TGF-β1,IGF-1,和CTGF表達(dá)升高。此外,共培養(yǎng)后的髓核細(xì)胞SOX9,COL2A1和ACAN明顯升高,提示髓核細(xì)胞功能有所恢復(fù)。結(jié)論:人脂肪干細(xì)胞在與髓核細(xì)胞接觸性共培養(yǎng)后可以向髓核細(xì)胞定向分化,同時也對髓核細(xì)胞具有營養(yǎng)和功能恢復(fù)的作用。這表明,脂肪干細(xì)胞可通過與髓核細(xì)胞的接觸性共培養(yǎng),對椎間盤細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重構(gòu)發(fā)揮潛在作用。實(shí)驗(yàn)二脂肪干細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后microRNA芯片分析實(shí)驗(yàn)背景及目的:在實(shí)驗(yàn)一中,我們通過脂肪干細(xì)胞在與髓核細(xì)胞接觸性共培養(yǎng),研究發(fā)現(xiàn)了脂肪干細(xì)胞在m RNA方面的變化。近年來研究發(fā)現(xiàn),非編碼RNA在椎間盤細(xì)胞生長、凋亡及相關(guān)蛋白合成等發(fā)揮重要作用。然而,國內(nèi)外目前關(guān)于干細(xì)胞在向髓核細(xì)胞分化過程中其micro RNAs(mi RNA)的變化仍不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用試驗(yàn)一獲得的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行mi RNAs基因芯片分析,旨在初步探索和研究脂肪干細(xì)胞向髓核細(xì)胞表型分化時的mi RNAs變化。方法:使用實(shí)驗(yàn)3中獲得及處理的6組脂肪干細(xì)胞,即與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞3組及無髓核細(xì)胞共培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞對照3組。常規(guī)獲得RNA后,于mi RCURYTM LNAArray(v.18.0)芯片上進(jìn)行雜交。結(jié)果:進(jìn)行分析的mi RNAs中有30個明顯差異表達(dá),包括11個上調(diào)的mi RNAs及19個下調(diào)的mi RNAs。標(biāo)準(zhǔn)化的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組和對照組間的mi RNA表達(dá)的差異性明顯。對芯片結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析我們得到micro RNAs的兩相等級簇狀熱圖,從總體上說明了各個樣本的mi RNAs差異表達(dá)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)初步篩查和探索研究了脂肪干細(xì)胞在被誘導(dǎo)分化表達(dá)髓核細(xì)胞表型后的上下調(diào)micro RNAs具體種類和變化規(guī)律,為將來進(jìn)一步研究干細(xì)胞在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構(gòu)中的micro RNAs變化提供了新思路。實(shí)驗(yàn)三脂肪干細(xì)胞在椎間盤髓核細(xì)胞壓力環(huán)境中對穩(wěn)態(tài)保護(hù)作用的研究實(shí)驗(yàn)背景及目的:在本部分的實(shí)驗(yàn)一、二中,我們研究了髓核細(xì)胞通過共培養(yǎng)對脂肪干細(xì)胞的作用影響。但是,目前關(guān)于脂肪干細(xì)胞對于髓核細(xì)胞的影響研究卻相對較少。同時,非生理壓力培養(yǎng)會導(dǎo)致髓核細(xì)胞的凋亡與退變。在IDD患者中,多數(shù)已經(jīng)存在脊柱的受力異常,在干細(xì)胞注射治療中,干細(xì)胞對殘存的退變髓核細(xì)胞的影響尚不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究脂肪干細(xì)胞在高壓培養(yǎng)下對髓核細(xì)胞的凋亡與功能的作用影響。方法:獲取并培養(yǎng)人椎間盤髓核細(xì)胞,分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組與人脂肪干細(xì)胞非接觸共培養(yǎng),置于3.0MPa的高壓環(huán)境中。對照組無脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng),其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同。48小時后通過流式細(xì)胞儀、細(xì)胞活死染色和掃描電鏡檢測兩組髓核細(xì)胞的凋亡,同時檢測髓核細(xì)胞的凋亡通路Caspases-3,-8和-9。另外,通過rt-PCR和免疫熒光染色檢測兩組髓核細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì),基質(zhì)金屬蛋白酶,金屬蛋白酶組織抑制因子,解聚蛋白樣金屬蛋白酶,炎性因子和細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)。結(jié)果:脂肪干細(xì)胞可通過阻斷Caspase-9和Caspase-3通路抑制髓核細(xì)胞在高壓培養(yǎng)下的凋亡。同時,脂肪干細(xì)胞可保護(hù)髓核細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(SOX9,COL2A1 and ACAN),金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1 and TIMP-2)基因表達(dá)和角蛋白8(CK8)蛋白表達(dá)。另外,脂肪干細(xì)胞可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3,-13),解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS-1,-5)和炎性因子(IL-1β,IL-6,TGF-β1,TNF-α)表達(dá)。結(jié)論:在非生理壓力培養(yǎng)下,脂肪干細(xì)胞可抑制髓核細(xì)胞凋亡,維持髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá),調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白酶活性、抑制炎性因子等途徑保護(hù)椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文人將以上觀點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，，以第一作者發(fā)表于 Int J Clin Exp Pathol (Ims in human intervertebral disc: the pros and cons, Sun Z, Zhang M, Zhao Xao Y, Samartzis D, Wang HQ, Luo ZJ. Int J Clin Exp Pathol. 201:1009-14. SCI, IF=1.581 分)。

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文抗炎細(xì)胞和相關(guān)水解酶，強(qiáng)化突出髓核組織的自體吸收。通過以上方法，不僅建椎間盤的免疫穩(wěn)態(tài)，還可有效緩解 IDD 導(dǎo)致的神經(jīng)痛。實(shí)際上，抗-TNF 療法床已經(jīng)證明對 IDD 引起的坐骨神經(jīng)痛具有初步療效 [92]。因此，重構(gòu)椎間盤免態(tài)對于治療 IDD 及相關(guān)神經(jīng)痛具有的治療意義（圖 2）。本人已 將以 上觀 點(diǎn)以第 一作 者 發(fā)表 于 Med Hypotheses 雜志 (Molecummunotherapy might shed a light on the treatment strategies for disc degeneration erniation. Sun Z, Liu ZH, Chen YF, Zhang YZ, Wan ZY, Zhang WL, Che L, Liuang HQ, Luo ZJ. Med Hypotheses. 2013 Sep;81(3):477-80. SCI, IF=1.136 分)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R681.5


本文編號：2521429