【摘要】：椎間盤退變是導致脊柱退行性病變的重要病理學基礎,其相關并發(fā)癥可引起椎間盤突出,椎管狹窄,椎體滑脫、脊柱不穩(wěn)、脊柱側(cè)彎等脊柱疾患,影響我國國民健康和生活質(zhì)量。在正常人體椎間盤中,存在多個重要的生理穩(wěn)態(tài),主要包括免疫穩(wěn)態(tài)、細胞穩(wěn)態(tài)、細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)及氧穩(wěn)態(tài)等。它們之間相互聯(lián)系,密切相關。同時,它們也在不同的年齡階段保持動態(tài)的生理平衡。這些穩(wěn)態(tài)的維持是保證椎間盤正常生理功能的重要條件和基礎。當穩(wěn)態(tài)因不同的內(nèi)因或外因被打破時,椎間盤退變的進程便悄然開始;與此同時,椎間盤的病理發(fā)展也會加快各穩(wěn)態(tài)失衡。目前對于椎間盤退變機制的研究,究其根本多是圍繞其穩(wěn)態(tài)失衡這一核心展開;而對于椎間盤退變的治療和椎間盤再生,通過生物材料、干細胞及刺激因子等各種途徑進行穩(wěn)態(tài)重構和維持是恢復椎間盤正常功能的重要前提基礎。本研究旨在針對椎間盤中存在的多個重要生理穩(wěn)態(tài),分別從不同角度對椎間盤的免疫穩(wěn)態(tài)、細胞穩(wěn)態(tài)、細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)及氧穩(wěn)態(tài)進行椎間盤退變機制的研究分析,并通過應用生物材料和脂肪干細胞進行穩(wěn)態(tài)的干預和重構,圍繞穩(wěn)態(tài)這一核心,對椎間盤退變和再生機制進行深入研究。整個研究分為以下四個部分(其中第四部分包括三個實驗)。第一部分椎間盤免疫穩(wěn)態(tài)中Fas L對維持無血管化的作用研究實驗背景及目的:椎間盤是人體最大的無血管器官,血管浸潤帶來的免疫細胞和炎性介質(zhì)可引起椎間盤內(nèi)部免疫穩(wěn)態(tài)失衡。Fas L為II型跨膜蛋白,當Fas L與其配體Fas結合后,可激活表達有Fas細胞的下游凋亡通路,導致細胞凋亡。資料顯示Fas L在正常椎間盤髓核細胞中具有陽性表達,同時血管內(nèi)皮細胞有Fas陽性表達。因此,該部分旨在觀察髓核細胞Fas L對于血管內(nèi)皮細胞的作用影響,研究Fas L對椎間盤維持無血管化的分子機制,探討其對椎間盤免疫穩(wěn)態(tài)維持的作用影響。方法:分別獲得人椎間盤髓核細胞和血管內(nèi)皮細胞系(HMEC-1細胞),構建慢病毒上調(diào)人髓核細胞Fas L表達,ELISA檢測髓核細胞培養(yǎng)液中可溶性Fas L(s Fas L)的表達水平。建立髓核細胞與HMEC-1細胞的非接觸共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)48h后消化收集細胞,對共培養(yǎng)后HMEC-1細胞進行流式凋亡檢測,同時檢測其Fas及相關凋亡通路的表達。結果:在髓核細胞的培養(yǎng)液中存在s Fas L表達,其濃度隨椎間盤退變表達降低。通過慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)Fas L的髓核細培養(yǎng)液中的s Fas L表達水平高于無病毒轉(zhuǎn)染組。HMEC-1細胞的凋亡率在正常髓核細胞共培養(yǎng)組明顯高于退變髓核細胞共培養(yǎng)組。在上調(diào)髓核細胞Fas L表達后,髓核細胞可誘導HMEC-1細胞凋亡率增高。同時,HMEC-1細胞與髓核細胞共培養(yǎng)后,細胞中的Fas表達、相關凋亡通路FADD和Caspase-3表達也升高。結論:椎間盤髓核細胞表達的Fas L可誘導血管內(nèi)盤細胞凋亡,在抑制血管浸潤、阻斷免疫細胞進入椎間盤發(fā)揮潛在功能。這些結果提示Fas L在維持椎間盤的免疫穩(wěn)態(tài)中的重要作用。第二部分椎間盤細胞穩(wěn)態(tài)中CK8在髓核細胞中的表型與降解機制研究實驗背景及目的:角蛋白8(Cytokeratin 8,CK8)是角蛋白家族的重要一員,在細胞維持正常結構和形狀、對生物力自體保護、蛋白分泌及細胞凋亡等多方面發(fā)揮重要作用。然而,目前研究對于CK8在髓核細胞中的表型及在退變髓核中的降解機制仍不明確,鑒于CK8表達及磷酸化與生物力學緊密相關,我們設想其在髓核細胞中的表達也受到壓力影響。因此,本實驗通過將髓核細胞置于高壓培養(yǎng)環(huán)境,觀察壓力對其磷酸化和降解的調(diào)節(jié)機制。方法:首先,獲得人椎間盤髓核組織,應用Western blot和免疫熒光檢測CK8與磷酸化CK8在髓核中的表達。然后,獲得并培養(yǎng)髓核細胞,將其分別置于3.0Mpa下培養(yǎng)4h,24h和48h,或于0.3Mpa,1.0Mpa及3.0Mpa下培養(yǎng)48h。應用Western blot和免疫共沉淀反應檢測壓力培養(yǎng)后髓核細胞CK8的磷酸化表達及其可溶性表達水平與壓力培養(yǎng)時間和強度的相關性。同時,通過應用蛋白激酶C(PKC)激活劑和抑制劑進行髓核細胞PKC活性與CK8磷酸化關系的檢測。結果:CK8在正常髓核細胞中的表達高于退變髓核細胞;而磷酸化CK8在退變髓核細胞中表達高于正常髓核細胞。髓核細胞CK8的磷酸化水平與可溶性形式隨培養(yǎng)壓力強度增加和時間延長表達明顯升高。PKC-ε活性隨壓力強度和時間延長升高。在加入PKC激活劑PMA后,髓核細胞中的CK8表達降低,而磷酸化表達升高;加入PKC抑制劑Bis后,高壓培養(yǎng)并未使髓核細胞中的p CK8表達升高。結論:過度壓力可通過誘導CK8降解,破壞髓核細胞骨架結構,對髓核細胞穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不利影響。而PCK激活和其誘導的CK8磷酸化分解是這一現(xiàn)象的重要機制。該部分結果揭示了生物壓力在椎間盤細胞穩(wěn)態(tài)中對髓核細胞骨架蛋白表達調(diào)控的分子作用機制。第三部分全氟三丁胺(PFTBA)在椎間盤氧穩(wěn)態(tài)重構中的作用研究實驗背景及目的:研究發(fā)現(xiàn),椎間盤內(nèi)部并不為完全缺氧組織,氧穩(wěn)態(tài)失衡是引發(fā)椎間盤退變的重要原因。因此,特定氧穩(wěn)態(tài)在椎間盤維持正常生理功能中發(fā)揮重要作用。目前,在椎間盤再生的相關生物材料學研究中,對于如何維持生物支架內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)穩(wěn)態(tài),特別是氧的穩(wěn)態(tài)仍不明確。PFTBA是應用于組織工程學中常見的供氧載體,其具有安全、無毒、穩(wěn)定釋放氧氣等特點。因此,該部分旨在應用PFTBA為氧穩(wěn)態(tài)重構的氧濃度調(diào)節(jié)因子,闡明其在椎間盤再生中對髓核細胞命運及功能的影響。方法:制備藻酸鹽凝膠與PFTBA復合物,分別調(diào)整其PFTBA濃度為2.5%,5%和10%。首先,進行物理性質(zhì)的檢測,包括腫脹,分解和氧氣釋放系數(shù)。同時,應用掃描電鏡觀察不同濃度PFTBA藻酸鹽凝膠的微觀結構。之后,在PFTBA藻酸鹽凝膠中復合人椎間盤髓核細胞,分別進行平面(2D)和三維(3D)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的細胞中應用live/dead染色,CCK-8檢測和細胞計數(shù)等檢測分析細胞在不同濃度PFTBA藻酸鹽中在無氧和常氧環(huán)境中的生存率和增殖情況。應用rt-PCR,免疫細胞化學檢測和ELISA檢測分析細胞外基質(zhì)和髓核標記物的表達。在體內(nèi)實驗中,建立動物椎間盤退變模型,將含有不同濃度的PFTBA藻酸鹽復合物注入動物退變椎間盤,在一定時間后分析動物椎間盤的影像學和組織學資料,研究和評估其椎間盤狀態(tài)。結果:PFTBA在本實驗范圍內(nèi)的濃度對藻酸鹽凝膠的物理特性并無顯著影響。藻酸鹽凝膠的氧氣釋放濃度與PFTBA濃度呈正相關。在體外細胞實驗中,PFTBA在無氧環(huán)境中對髓核細胞的生存和增殖具有不同程度的促進作用。同時,含有2.5%PFTBA的藻酸鹽凝膠可在無氧培養(yǎng)中促進髓核細胞合成類似于髓核組織的細胞外基質(zhì)成分,且對髓核細胞標記物表達無明顯作用影響。在體內(nèi)研究中,我們發(fā)現(xiàn)2.5%PFTBA可保護動物椎間盤高度系數(shù)DHI和相關細胞外基質(zhì)的表達,維持椎間盤的正常生理結構,對椎間盤退變具有治療作用。結論:該部分研究在國內(nèi)外首次應用PFTBA為氧濃度調(diào)控因子,進行椎間盤氧穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)和維持。應用體外和體內(nèi)實驗,我們發(fā)現(xiàn)PFTBA可通過重構椎間盤氧穩(wěn)態(tài)促進髓核再生,對椎間盤再生的組織工程學研究具有重要意義。第四部分脂肪干細胞在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構中的作用研究目前,干細胞在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構和組織工程學中受到了廣泛關注和研究。其中,脂肪干細胞由于其取材易、來源廣等優(yōu)點,在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構和維持中發(fā)揮重要作用。本部分為三個實驗,旨在通過脂肪干細胞與髓核細胞的共培養(yǎng),重點分析脂肪干細胞對椎間盤的細胞穩(wěn)態(tài)、細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)重構的重要調(diào)節(jié)作用,同時觀察脂肪干細胞在椎間盤非生理壓力環(huán)境中的保護作用,從多角度研究脂肪干細胞對椎間盤各穩(wěn)態(tài)的重構作用機制。實驗一接觸性共培養(yǎng)對脂肪干細胞在椎間盤細胞穩(wěn)態(tài)重構的作用研究實驗背景及目的:目前國內(nèi)外實驗對于人脂肪干細胞和椎間盤髓核細胞接觸性共培養(yǎng)方面的研究相對較少。因此,本實驗旨在通過對脂肪干細胞與髓核細胞的接觸性共培養(yǎng),初步研究脂肪干細胞在椎間盤細胞穩(wěn)態(tài)重構中的作用。方法:分別培養(yǎng)并獲得人脂肪干細胞和椎間盤髓核細胞。對獲得的脂肪干細胞進行表面標記物流式細胞鑒定。通過CFDA熒光標記脂肪干細胞,之后建立脂肪干細胞和髓核細胞的接觸性共培養(yǎng)體系。7天后流式分離熒光標記的脂肪干細胞和無熒光的髓核細胞,通過rt-PCR分析兩種細胞的分子變化。結果:人脂肪干細胞和髓核細胞生長良好。流式鑒定顯示脂肪干細胞標記物CD29,CD90等表達在90%以上。共培養(yǎng)后流式分離兩組細胞的細胞純度均高于99%。Rt-PCR顯示共培養(yǎng)后脂肪干細胞的SOX9,COL2A1,ACAN和COL6A2表達明顯升高,其髓核細胞標記物FOXF1,PAX1,CA12,和HBB也明顯升高。同時,其相關生長因子如CDMP-1,TGF-β1,IGF-1,和CTGF表達升高。此外,共培養(yǎng)后的髓核細胞SOX9,COL2A1和ACAN明顯升高,提示髓核細胞功能有所恢復。結論:人脂肪干細胞在與髓核細胞接觸性共培養(yǎng)后可以向髓核細胞定向分化,同時也對髓核細胞具有營養(yǎng)和功能恢復的作用。這表明,脂肪干細胞可通過與髓核細胞的接觸性共培養(yǎng),對椎間盤細胞穩(wěn)態(tài)的重構發(fā)揮潛在作用。實驗二脂肪干細胞與髓核細胞共培養(yǎng)后microRNA芯片分析實驗背景及目的:在實驗一中,我們通過脂肪干細胞在與髓核細胞接觸性共培養(yǎng),研究發(fā)現(xiàn)了脂肪干細胞在m RNA方面的變化。近年來研究發(fā)現(xiàn),非編碼RNA在椎間盤細胞生長、凋亡及相關蛋白合成等發(fā)揮重要作用。然而,國內(nèi)外目前關于干細胞在向髓核細胞分化過程中其micro RNAs(mi RNA)的變化仍不明確。因此,本實驗應用試驗一獲得的脂肪干細胞進行mi RNAs基因芯片分析,旨在初步探索和研究脂肪干細胞向髓核細胞表型分化時的mi RNAs變化。方法:使用實驗3中獲得及處理的6組脂肪干細胞,即與髓核細胞共培養(yǎng)的脂肪干細胞3組及無髓核細胞共培養(yǎng)的脂肪干細胞對照3組。常規(guī)獲得RNA后,于mi RCURYTM LNAArray(v.18.0)芯片上進行雜交。結果:進行分析的mi RNAs中有30個明顯差異表達,包括11個上調(diào)的mi RNAs及19個下調(diào)的mi RNAs。標準化的相關性分析結果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組和對照組間的mi RNA表達的差異性明顯。對芯片結果進行進一步分析我們得到micro RNAs的兩相等級簇狀熱圖,從總體上說明了各個樣本的mi RNAs差異表達。結論:本實驗初步篩查和探索研究了脂肪干細胞在被誘導分化表達髓核細胞表型后的上下調(diào)micro RNAs具體種類和變化規(guī)律,為將來進一步研究干細胞在椎間盤穩(wěn)態(tài)重構中的micro RNAs變化提供了新思路。實驗三脂肪干細胞在椎間盤髓核細胞壓力環(huán)境中對穩(wěn)態(tài)保護作用的研究實驗背景及目的:在本部分的實驗一、二中,我們研究了髓核細胞通過共培養(yǎng)對脂肪干細胞的作用影響。但是,目前關于脂肪干細胞對于髓核細胞的影響研究卻相對較少。同時,非生理壓力培養(yǎng)會導致髓核細胞的凋亡與退變。在IDD患者中,多數(shù)已經(jīng)存在脊柱的受力異常,在干細胞注射治療中,干細胞對殘存的退變髓核細胞的影響尚不明確。因此,本實驗旨在研究脂肪干細胞在高壓培養(yǎng)下對髓核細胞的凋亡與功能的作用影響。方法:獲取并培養(yǎng)人椎間盤髓核細胞,分為實驗組和對照組。實驗組與人脂肪干細胞非接觸共培養(yǎng),置于3.0MPa的高壓環(huán)境中。對照組無脂肪干細胞共培養(yǎng),其他條件與實驗組相同。48小時后通過流式細胞儀、細胞活死染色和掃描電鏡檢測兩組髓核細胞的凋亡,同時檢測髓核細胞的凋亡通路Caspases-3,-8和-9。另外,通過rt-PCR和免疫熒光染色檢測兩組髓核細胞的細胞外基質(zhì),基質(zhì)金屬蛋白酶,金屬蛋白酶組織抑制因子,解聚蛋白樣金屬蛋白酶,炎性因子和細胞標記物表達。結果:脂肪干細胞可通過阻斷Caspase-9和Caspase-3通路抑制髓核細胞在高壓培養(yǎng)下的凋亡。同時,脂肪干細胞可保護髓核細胞的細胞外基質(zhì)(SOX9,COL2A1 and ACAN),金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1 and TIMP-2)基因表達和角蛋白8(CK8)蛋白表達。另外,脂肪干細胞可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3,-13),解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS-1,-5)和炎性因子(IL-1β,IL-6,TGF-β1,TNF-α)表達。結論:在非生理壓力培養(yǎng)下,脂肪干細胞可抑制髓核細胞凋亡,維持髓核細胞細胞外基質(zhì)表達,調(diào)節(jié)相關蛋白酶活性、抑制炎性因子等途徑保護椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。
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第四軍醫(yī)大學博士學位論文人將以上觀點進行總結，，以第一作者發(fā)表于 Int J Clin Exp Pathol (Ims in human intervertebral disc: the pros and cons, Sun Z, Zhang M, Zhao Xao Y, Samartzis D, Wang HQ, Luo ZJ. Int J Clin Exp Pathol. 201:1009-14. SCI, IF=1.581 分)。

第四軍醫(yī)大學博士學位論文抗炎細胞和相關水解酶，強化突出髓核組織的自體吸收。通過以上方法，不僅建椎間盤的免疫穩(wěn)態(tài)，還可有效緩解 IDD 導致的神經(jīng)痛。實際上，抗-TNF 療法床已經(jīng)證明對 IDD 引起的坐骨神經(jīng)痛具有初步療效 [92]。因此，重構椎間盤免態(tài)對于治療 IDD 及相關神經(jīng)痛具有的治療意義（圖 2）。本人已 將以 上觀 點以第 一作 者 發(fā)表 于 Med Hypotheses 雜志 (Molecummunotherapy might shed a light on the treatment strategies for disc degeneration erniation. Sun Z, Liu ZH, Chen YF, Zhang YZ, Wan ZY, Zhang WL, Che L, Liuang HQ, Luo ZJ. Med Hypotheses. 2013 Sep;81(3):477-80. SCI, IF=1.136 分)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.5


本文編號：2521429