【摘要】：目的：構(gòu)建過表達(dá)和沉默Idl基因的慢病毒載體,以兔椎間盤髓核細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察經(jīng)BMP一2誘導(dǎo)后的髓核細(xì)胞內(nèi)Idl基因的表達(dá)水平調(diào)整以后細(xì)胞分泌軟骨特性因子的變化,研究Idl在BMPs維持椎間盤細(xì)胞軟骨表型中的作用。方法：(1)設(shè)計(jì)針對(duì)Id1基因過表達(dá)和RNA干擾(RNAi)的序列,應(yīng)用基因重組技術(shù)將目的基因片段連接到慢病毒載體,然后感染293T細(xì)胞之后進(jìn)行測(cè)序鑒定與病毒滴度檢測(cè)；(2)以兩種慢病毒分別感染兔髓核細(xì)胞,QRT-PCR和Western blot檢測(cè)髓核細(xì)胞Id1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；(3)重組腺病毒AdBMP2感染髓核細(xì)胞后,利用已制備的兩種慢病毒再次感染細(xì)胞,QRT-PCR、ELISA檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)軟骨特性分子的能力與變化趨勢(shì)。結(jié)果：(1)成功構(gòu)建Id1基因過表達(dá)與RNAi漫病毒載體,測(cè)序結(jié)果與Id1基因序列比對(duì)后確認(rèn)一致。(2)慢病毒感染髓核細(xì)胞后,Id1基因的mRNA與蛋白的表達(dá)量與正常細(xì)胞組及空載病毒感染組比,過表達(dá)組增加,RNAi組下降,符合預(yù)期結(jié)果。(3)細(xì)胞內(nèi)Idl的表達(dá)增加可促進(jìn)軟骨特性因子col Ⅱ(0.407±0.083)和ACAN(0.284±0.074)的mRNA表達(dá)。(4)AdBMP2處理細(xì)胞后,Id1基因表達(dá)增加可使col II(0.590±0.072)和ACAN(0.351±0.066)的mRNA表達(dá)進(jìn)一步顯著升高；Idl表達(dá)降低時(shí),以上因子的表達(dá)被明顯抑制(col II:0.244±0.060,ACAN:0.168±0.034).結(jié)論：Idl能夠促進(jìn)兔椎間盤髓核細(xì)胞軟骨特性分子的表達(dá),細(xì)胞內(nèi)Idl基因水平變化能夠顯著影響B(tài)MP-2誘導(dǎo)細(xì)胞分泌軟骨特性因子。Idl是BMP-2維持兔髓核細(xì)胞軟骨特性作用的關(guān)鍵因子。
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圖片說明： Ｆｉｇ２－４邋Ｓ邋Ｔｈｅ邋ｉｎ化ｎｓｉｔｙ邋ｏｆ邋化ｒｇｅｔ邋ｂａｎｄ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｗｅｓ化ｍ邋ｂｌｏｔ逡逑２．２．邋４邋Ｉｄｌ度病毒與ＡｄＢＭＰ２轉(zhuǎn)染細(xì)化后軟肯特性分子的表達(dá)逡逑ＱＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)軟骨特性分子ｃｏｌ邋ＩＩ、ＡＣＡＮ和Ｉｄｌ如表２－２、圖２－５所示，（１）邋ＢＭＰ２逡逑組與ＧＦＰ姐相比，ｃｏｉｎ、ＡＣＡＮ、Ｉｄｌ的ｍＲＮＡ表達(dá)量明顯增加。（２）邋Ｉｄｌ過表達(dá)慢病毒逡逑＋Ｇ巧組與ＧＦＰ組相比，ｃｏｌｌｉ、ＡＣＡＮ、Ｉｄｌ表達(dá)量均增加；ＲＮＡｉ＋ＧＦＰ組與Ｇ巧組相比逡逑Ｗ上因子表達(dá)量減少。（３）邋Ｉｄｌ過表達(dá)慢病毒＋ＢＭＰ２組與ＢＭＰ２感染組相比，Ｉｄｌ的表逡逑達(dá)增加能夠最著促進(jìn)ｃｏｌ邋ＩＩ、ＡＣＡＮ、Ｉｄｌ表達(dá)量顯著增加；Ｉｄｌ邋ＲＮＡｉ慢病毒＋ＢＭＰ２組與逡逑ＢＭＰ２組相比，Ｉｄｌ表達(dá)減少后，ＢＭＰ２誘導(dǎo)軟骨樣特性因子分泌的作用被明顯抑制。上逡逑述組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。＜化０５）。逡逑表２－２：巧光定ｆＰＣＲ檢抓各組細(xì)化ｃｏｉｎ、ＡＣＡＮ、Ｉｄｌ的ｍＲＮＡ的表達(dá)（ｎ－３，文±邋Ｓ）逡逑Ｔａｂ２－２：ｍＲＮＡｅｘｐｉ＊ｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｉｎ、ＡＣＡＮ、ＩｄｌｄｅＷｄｅｄｂ》＇ＱＲＴ－ＰＣＲ（ｆｌ—３，Ａ＂±Ｓ）逡逑
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.5

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本文編號(hào)：2516038