【摘要】：研究背景及意義下腰痛是多數(shù)成年人工作缺勤、就醫(yī)、住院治療最普遍的原因,其主要病因是腰椎間盤(pán)發(fā)生退變[1]。退變本質(zhì)特征是盤(pán)內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)量減少和功能降低(細(xì)胞衰老[2-3]、凋亡[4-5])。最先發(fā)生椎間盤(pán)退變隨病程進(jìn)展出現(xiàn)腰椎間盤(pán)突出、椎管狹窄、甚至癱瘓等神經(jīng)損傷癥狀影響正常生活。目前主要通過(guò)藥物、手術(shù)僅限于解除癥狀,在臨床長(zhǎng)期的療效上很局限。近年在微創(chuàng)下注射生長(zhǎng)因子、基因治療、移植生物材料或干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程為求替代髓核并刺激再生成為研究熱點(diǎn)。髓核組織工程為重建退變椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)和功能提供新的治療方式。健康的、年輕的髓核細(xì)胞是作為種子細(xì)胞的理想選擇,但其體外大量擴(kuò)增困難、物種來(lái)源有限阻礙臨床應(yīng)用。干細(xì)胞可以多向分化后可以替代髓核細(xì)胞,而且可以較長(zhǎng)時(shí)間保持髓核細(xì)胞形態(tài)和表型。人體各個(gè)組織中均含有干細(xì)胞如脂肪、上皮、牙髓、骨髓、肌肉、腱、經(jīng)血[6-15]等,如脂肪中干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,但大部分種子細(xì)胞存在組織中的含量少且有創(chuàng)、來(lái)源有限并不能滿足臨床需要。為此尋找種子細(xì)胞新來(lái)源已成為髓核組織工程研究中的“瓶頸”難題之一。我們從黃韌帶組織中分離出來(lái)的干細(xì)胞有望成為新的種子細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)對(duì)LFSCs(ligamentum flavum stem cells,黃韌帶干細(xì)胞)向NP(nucleus pulposus,髓核細(xì)胞)分化的可行性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。篩選出純度較高的LFSCs是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ),目前多根據(jù)干細(xì)胞表面標(biāo)志物方法使用免疫磁珠篩選、根據(jù)細(xì)胞大小密度梯度離心、多種介質(zhì)包被貼壁粘附法等進(jìn)行初篩上述手段只能去除大部分成熟細(xì)胞而且由于價(jià)格昂貴和本身干細(xì)胞缺少特異性標(biāo)記物限制其應(yīng)用。黃韌帶干細(xì)胞高表達(dá)蛋白整合素α5β1和αvβ3,凝血促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)α5β1、αvβ3和纖連蛋白,我們可以利用凝血酶和Fibronectin可以很好的粘附黃韌帶干細(xì)胞而且純度高�；谠邳S韌帶干細(xì)胞分離、篩選的基礎(chǔ)上,從形態(tài)變化、免疫表型、CCK8檢測(cè)增殖能力、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、干性基因、成骨成軟骨成脂肪上探討黃韌帶干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力。隨后模擬椎間盤(pán)缺氧、3D共培養(yǎng)模式下,檢測(cè)誘導(dǎo)分化后黃韌帶干細(xì)胞表達(dá)髓核特異性基因和蛋白表達(dá)以評(píng)價(jià)其可行性。眾所周知notch通路在控制分化中占有重要作用,notch通路下游分子twist-1控制干細(xì)胞向軟骨系分化,而缺氧控制notch通路在分化問(wèn)題上仍有爭(zhēng)議。研究黃韌帶干細(xì)胞在低氧下是否能向髓核分化需對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步了解,目前hif-1α調(diào)節(jié)twist-1是否在黃韌帶干細(xì)胞向髓核分化中發(fā)揮重要作用,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。我們從干細(xì)胞分化表面標(biāo)志物和特性蛋白發(fā)生改變證明了lfscs可以向np-like方向分化。通過(guò)構(gòu)建lentivirus-hif-1α過(guò)表達(dá)載體觀察對(duì)twist1表達(dá)的影響初步證明其抑制關(guān)系,對(duì)缺氧因素在向髓核樣(軟骨系)分化中的作用進(jìn)行了探討,以期為髓核組織工程中新的種子細(xì)胞來(lái)源及其定向分化提供理論基礎(chǔ)。研究方法:1.干細(xì)胞篩選方法:從微創(chuàng)手術(shù)中獲得人lf,通過(guò)機(jī)械-酶消化-組織貼壁法聯(lián)合獲取原代細(xì)胞后,接種于4u/ml凝血酶聯(lián)合8μg/cm2fibronectin、8μg/cm2fibronectin、4u/ml凝血酶和bsa包被過(guò)的培養(yǎng)瓶,od值代表粘附率,流式比較篩選百分比。2.自我更新和多能性檢測(cè):對(duì)干細(xì)胞表型、表達(dá)相關(guān)特異性蛋白、多向分化能力進(jìn)行檢測(cè)。從細(xì)胞周期、增殖能力和干性基因表達(dá)與bm-mscs進(jìn)行差異比較了解其特征。3.誘導(dǎo)lfscs向np-like細(xì)胞分化:模擬低氧環(huán)境和3d培養(yǎng)方法,分低氧和常氧組并分別與髓核細(xì)胞(npcs)等比例貼附于transwell嵌套系統(tǒng)1μm膜的上下面進(jìn)行接觸式共培養(yǎng),對(duì)照組為20%o2培養(yǎng)的黃韌帶干細(xì)胞。rt-pcr檢測(cè)共培養(yǎng)第14天髓核特異性表達(dá)基因sox-9,collagen-ii,aggrecan,krt19,ca12,foxf1,hif-1α。蛋白質(zhì)印跡法測(cè)試aggrecan,collagen-ii,hif-1α和sox9。流式細(xì)胞儀檢測(cè)低氧下共培養(yǎng)黃韌帶干細(xì)胞0天,14天,21天分化表型變化及免疫組化染色檢測(cè)collagen-i、collagen-ii、aggrecan表達(dá)情況。4.低氧下黃韌帶干細(xì)胞產(chǎn)生的hif-1α對(duì)其notch通路中twist1的影響:構(gòu)建hif-1α慢病毒過(guò)表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染黃韌帶干細(xì)胞48小時(shí)觀察twist1熒光變化。采用成軟骨分化培養(yǎng)液培養(yǎng)hif-1α慢病毒過(guò)表達(dá)的黃韌帶干細(xì)胞,阿里新蘭染色觀察第3、7天成軟骨變化,未轉(zhuǎn)染為陰性對(duì)照組。rt-pcr檢測(cè)第3天和第7天微球軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的黃韌帶干細(xì)胞twist1、ii型膠原、蛋白聚糖基因表達(dá)水平,wb定量檢測(cè)6h、24h、48htwist1的蛋白變化情況。結(jié)果:1.黃韌帶干細(xì)胞高表達(dá)α5β1和αvβ3,使用8μg/cm2fibronectin和4u/ml凝血酶包被培養(yǎng)瓶篩選黃韌帶干細(xì)胞篩選后細(xì)胞呈均一長(zhǎng)梭形,粘附率od值明顯高于對(duì)照組(p0.05),篩選純度高。2.lfscs表面標(biāo)志物cd105+,cd44+,cd73+,cd90+和cd29+。cd45-,cd34-,cd133-,stro-1-。三系分化:alizarinred陽(yáng)性,oilredo染色可見(jiàn)紅色脂滴形成,alcianblue染色可見(jiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)agg呈陽(yáng)性表現(xiàn)。表達(dá)骨標(biāo)志物:oc、alp、runx-2,脂肪標(biāo)志物:lpl、app、ppar2,軟骨標(biāo)志物:colii、agg、sox9顯著上調(diào),其中runx-2在未誘導(dǎo)組有低水平表達(dá)。免疫組化比較lfscs和bm-mscs均表達(dá)α-sma、colli、fibronectin,都不表達(dá)collii。與bm-mscs比較有相似增殖能力。細(xì)胞周期分析lfscs和bmscs處于g0/g1期比例均超過(guò)80%。nonag、sox2在lfscs和bm-mscs之間表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),而oct-4在lfscs中表達(dá)水平明顯高于bm-msc(p0.05)。3.經(jīng)過(guò)14天接觸性共培養(yǎng)后,rt-pcr檢測(cè)分化后黃韌帶干細(xì)胞表達(dá)髓核特異性標(biāo)志物krt19,ca12,acan,col2a1,sox-9,hif-1α低氧組均明顯高于常氧組(p0.05),而foxf1在2%o2和20%o2之間無(wú)明顯差異(p0.05)。western-blot檢測(cè)蛋白colii、agg、sox9、hif-1α與基因水平一致,其中hif-1α在對(duì)照組也有低水平表達(dá)。4.低氧共培養(yǎng)的黃韌帶干細(xì)胞表型在分化過(guò)程中發(fā)生變化,黃韌帶干細(xì)胞高表達(dá)cd105、cd271,低表達(dá)gd2、tie2、cd24,誘導(dǎo)共培養(yǎng)14天后干性抗體均有下降趨勢(shì)而cd24表達(dá)上調(diào)。21天后cd24、cd271低表達(dá),而cd105、gd2、tie2為陰性。免疫組化提示隨著lfscs向np-like發(fā)生分化,表達(dá)特異性蛋白collii、agg,未表達(dá)colli。5.微球軟骨誘導(dǎo)小球在第3天和第7天時(shí),過(guò)表達(dá)hif-1α組阿利新蘭染色較未轉(zhuǎn)染組染色深。realtime-pcr過(guò)表達(dá)hif-1α抑制notch通路中twist1的表達(dá),促進(jìn)ii型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)(p0.05)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)twist1熒光染色顯示轉(zhuǎn)染組熒光明顯減弱,蛋白定量6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)twist1表達(dá)量逐漸下降(p0.05)。結(jié)論:1.本研究通過(guò)對(duì)微創(chuàng)手術(shù)取下的黃韌帶組織中含有的干細(xì)胞進(jìn)行篩選方法的研究并對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定,確立了4u/ml凝血酶聯(lián)合8μg/cm2fibronectin粘附法,該方法可顯著提高lfscs的粘附率,以利于lfscs的分離與篩選。并發(fā)現(xiàn)了lfscs表達(dá)stro-1為陰性,與bm-mscs相比oct-4表達(dá)水平高。證明了lfscs具備自我更新和多向分化潛能的特征。2.基于模擬體內(nèi)椎間盤(pán)低氧和共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)lfscs向np-like分化,為探討LFSCs作為髓核組織工程種子細(xì)胞的可行性�，F(xiàn)總結(jié)如下:1)在低氧下LFSCs與NP共培養(yǎng),我們根據(jù)目前研究鑒定向髓核分化比較有特異性的標(biāo)志物,從形態(tài)、表型變化、基因和蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證了黃韌帶干細(xì)胞在低氧情況下更有利于向髓核分化,有望成為組織工程種子細(xì)胞。2)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了低氧下黃韌帶干細(xì)胞表達(dá)HIF-1α抑制Notch通路下游基因Twist1的表達(dá),Twist1的作用抑制軟骨系分化,故HIF-1α相當(dāng)于促進(jìn)了向軟骨系分化的進(jìn)程,但調(diào)控具體機(jī)制還需進(jìn)一步長(zhǎng)時(shí)間體內(nèi)證實(shí)。3)我們應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)從干細(xì)胞分化過(guò)程的表型變化入手,鑒定了分化表型的變化。提示在體外分化成某一階段有特定表型,如分化成髓核的祖細(xì)胞或前體細(xì)胞,既可以維持定向分化又可以降低成瘤的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)將來(lái)種子細(xì)胞移植入椎間盤(pán)后的命運(yùn)具有重要意義。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.53

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張濤;阮狄克;王德利;王超鋒;;組織工程髓核種子細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;2012年02期

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本文編號(hào)：2413164