【摘要】：人類疾病中有許多是與骨相關的,如骨質疏松、軟骨發(fā)育不良、骨性關節(jié)炎等。因此,深入研究骨發(fā)育的分子機制對于疾病診斷、預防和治療意義重大。脊椎動物的骨形成主要有兩種形式：膜內成骨(Intramembranous ossification)和軟骨內成骨(Endochondral ossification)。軟骨內成骨過程是一個復雜的多步驟過程,起始于肢芽間充質干細胞的增殖和聚集,然后會先后經歷軟骨細胞分化、軟骨細胞肥大化、肥大軟骨細胞成熟凋亡、血管入侵及成骨分化步驟。Rho家族的小G蛋白(Rho small GTPase)成員包括Rac1、Cdc42和Rho A,可以在GTP形式與GDP形式間轉換,從而作為信號傳導途徑的“分子開關”調節(jié)細胞周期、細胞運動、基因轉錄活性、信號傳導等重要功能。近幾年有報道指出Rac1可以調控經典Wnt信號促進成骨分化,基因敲除小鼠與體外細胞培養(yǎng)的結果顯示Rac1與Cdc42調控軟骨內成骨過程,但具體的分子機制尚不完全清楚。我們通過體外細胞學研究及條件性敲除小鼠研究揭示了Cdc42在軟骨內成骨過程中具有重要作用,并對其調控機制進行了一定的探討,對軟骨內成骨的機制及Rho家族小G蛋白的功能進行了很好的補充。小鼠肢芽組織由頂外胚層嵴(Apical ectodermal ridge, AER)信號中心與極化活性區(qū)(Zone of polarizing activity, ZPA)兩部分組成。首先我們通過觀察頂端外胚層嵴敲除Cdc42 (Msx2Cre;Cdc42f/f)的轉基因小鼠,發(fā)現(xiàn)Cdc42并不參與調控頂外胚層嵴的活性。間充質細胞敲除Cdc42 (PrxCre;Cdc42f/f)的小鼠呈現(xiàn)出四肢短粗、顱骨開放性缺失的表型,進一步的組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)Cdc42敲除的轉基因小鼠股骨中心有過度增生的肥大軟骨細胞,不能出現(xiàn)正常的血管入侵。上述表型充分說明Cdc42參與軟骨內成骨過程。為了明確小鼠骨發(fā)育異常的原因,首先我們取PrxCre;Cdc42f/f的小鼠股骨做成骨與軟骨分化標記基因的原位雜交,結果顯示成骨細胞及血管入侵的標記基因基本無異常。另外,在體外細胞學上我們分別檢測了成骨分化標記基因的表達、成骨分化轉錄因子Runx2的熒光素酶報告基因活性,并進行了成骨分化誘導的茜素紅染色明確礦物化結節(jié)形成能力；在整體動物上我們觀察了成骨細胞特異性敲除Cdc42的轉基因小鼠表型,結果均表明Cdc42基因敲除小鼠的骨骼異常是繼發(fā)于軟骨發(fā)育過程的,Cdc42并不能直接調控成骨細胞的分化,而是調控軟骨分化。軟骨分化過程起始于間充質細胞的增殖和聚集,而Sox9是軟骨發(fā)生早期階段的主要決定因子,對于間充質細胞的聚集是必須的。首先我們檢測了Sox9的whole mount原位雜交,結果顯示在E12.5天時Sox9應表達于尺、橈骨及跖骨形狀的細胞聚集區(qū)及其軟骨結構的部位,而缺失Cdc42的轉基因小鼠中Sox9的表達彌散于整個肢芽結構。然后我們通過小鼠胚胎成纖維細胞(C3H10T1/2)的微團培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)敲降Cdc42可以抑制BMP-2所誘導的細胞聚集,而持續(xù)激活Cdc42可以增強BMP-2的誘導作用。同時熒光定量PCR的結果顯示敲降Cdc42后顯著抑制細胞聚集的標記基因N-cadherin的表達。以上實驗結果均說明Cdc42在間充質細胞聚集過程中扮演了重要的角色。為了進一步探討Cdc42調控間充質細胞聚集的機制,我們在C3H10T1/2細胞上開展了一系列的研究。Western blot的結果顯示敲降Cdc42或抑制Pakl均抑制BMP-2誘導的Smad1/5與p38的磷酸化水平；核質分離結果顯示抑制p38或Pakl后抑制了Smad1/5的入核能力；免疫共沉淀的結果顯示p38與Smad5存在相互結合。上述結果說明Cdc42調控間充質細胞聚集可能是通過Pak1/p38/Smad信號通路。為了驗證此信號通路對細胞聚集的影響,我們再次利用C3H10T1/2細胞做微團培養(yǎng),結果發(fā)現(xiàn)敲降Smad4或抑制p38的活性都會抑制BMP-2誘導的細胞聚集,同時我們發(fā)現(xiàn)敲降Cdc42引起的聚集受抑制表型可以通過添加p38的激動劑挽救。最后我們選取PrxCre;Cdc42f/f的小鼠E11.5天的肢芽做免疫組化和western blot,結果顯示,與同窩仔比間充質細胞敲除Cdc42的小鼠肢芽中磷酸化的Smad與p38的水平有一定的下降。上述結果提示我們Cdc42調控間充質細胞聚集過程是通過BMP-2/Pak1/p38/Smad信號通路實現(xiàn)的。間充質細胞聚集后會向軟骨細胞分化,然后發(fā)生肥大化。實時熒光定量PCR的結果顯示,敲降Cdc42或抑制Pakl抑制TGF-β所誘導的軟骨分化的標記基因Col2a1的表達；熒光素酶報告基因檢測結果顯示軟骨分化的轉錄因子Sox9的熒光素酶報告基因活性同樣受到了抑制。結果提示Cdc42同樣參與軟骨細胞早期分化過程。進一步的體外細胞學實驗結果表明敲降Cdc42或抑制Pakl均對AKT1的活性及Sox9的磷酸化有一定的抑制作用,而且持續(xù)激活AKT1則能挽救敲降Cdc42導致的Sox9活性受抑制的結果。細胞核質分離的結果顯示敲降Cdc42或Pakl顯著降低了Sox9的入核能力。表明Cdc42調節(jié)軟骨細胞早期分化是通過Pakl激活AKT1所支配的Sox9的轉錄實現(xiàn)的。同時我們檢測了肥大軟骨細胞的標記基因Col10的表達、肥大軟骨細胞成熟的轉錄因子Runx2的轉錄活性等,均未發(fā)現(xiàn)Cdc42對其有影響。我們通過肥大軟骨細胞缺失Cdc42 (Col10Cre;Cdc42f/f)的轉基因小鼠骨骼制備及HE染色驗證了Cdc42缺失不參與軟骨細胞的肥大化及成熟過程。綜上所述, Cdc42正向調控間充質細胞聚集過程, 并通過BMP-2/Cdc42/Pak1/p38/Smad信號通路實現(xiàn)；通過TGF-β/Cdc42/Pak1/AKT1/Sox9信號事件調控軟骨細胞的早期分化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R68

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