【摘要】：研究背景:脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)是以造成患者損傷平面以下所支配區(qū)域感覺、運動功能及排尿、排便功能異常為主要臨床表現(xiàn)的一種高發(fā)性、難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。隨著社會經(jīng)濟和交通運輸業(yè)的發(fā)展,SCI的發(fā)生率呈逐年增高趨勢,嚴重影響患者生活質(zhì)量,由此也給患者、家人、國家?guī)砹藝乐氐纳鐣?jīng)濟負擔。目前對于SCI的研究雖然取得了一些可喜成果,但是在實際的臨床工作中,SCI的治療效果仍不理想,SCI的治療仍是醫(yī)學界一個有待攻克的難題�？梢�,開展SCI的治療研究是一個急迫且具有科學和社會意義的課題。SCI是一個長期的復雜的損傷過程:既包括受傷當時的直接機械暴力本身對神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管等的離斷、破壞所引起的原發(fā)性損傷,又包括損傷后一段時間內(nèi)的炎癥反應、組織水腫、組織缺氧、組織缺血、脂質(zhì)過氧化作用、谷氨酸受體過度激活、鈣離子超載通路激活等一系列因素導致的繼發(fā)性級聯(lián)損傷。SCI在直接導致神經(jīng)細胞死亡的同時,還可引起少突膠質(zhì)細胞大量死亡,進而導致軸突脫髓鞘改變,嚴重影響機體各種神經(jīng)功能的發(fā)揮。少突膠質(zhì)前體細胞(Oligodendrocyte Precursor Cells,OPCs)是少突膠質(zhì)細胞系發(fā)育的起始細胞,是還未成熟的少突膠質(zhì)細胞。一方面,OPCs具較強的增殖能力,能夠在體內(nèi)快速增殖;另一方面,OPCs能在特定信號因子的作用下定向遷移,最終分化為成熟少突膠質(zhì)細胞,包繞軸突形成髓鞘。已有相關(guān)研究結(jié)果表明:通過OPCs細胞移植,OPCs能夠在體內(nèi)存活,促進髓鞘形成,最終明顯改善SCI大鼠的運動、神經(jīng)功能。趨化因子除了早期發(fā)現(xiàn)的對炎癥細胞、骨髓細胞起傳統(tǒng)的趨化作用外,現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)在胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,神經(jīng)損傷后的修復過程中均具有不同程度的作用。在正常生理條件下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達CXCL12/CXCR4,起著介導神經(jīng)元前體細胞向最終功能區(qū)域定向遷移的作用。在病理條件下,CXCL12/CXCR4分子更是與神經(jīng)系統(tǒng)損傷、修復過程密切相關(guān)。已有文獻報道:CXCL12對脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞及其前體細胞、初級小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)前體細胞等多種細胞增殖、分化等生長均具有一定影響。也有發(fā)現(xiàn)CXCL12可以通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶3(Matrix Metalloproteinase3,MMP3)and基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase9,MMP9)的表達變化來影響神經(jīng)前體細胞的增殖和分化。因此,我們有理由推測CXCL12也有可能以類似的作用機制參與由神經(jīng)前體細胞分化而來的OPCs增殖、分化過程的調(diào)控。因此,本實驗擬行OPCs的分離純化,建立其體外培養(yǎng)模型,觀察其在體外生長、增殖情況。探索CXCL12對OPCs增殖的影響,并檢測CXCR4、CXCR7、MMP9在其中的重要作用,以期更好的了解OPCs增殖、分化特性,為后期研究移植后的OPCs在體內(nèi)存活、增殖、分化調(diào)節(jié),脫髓鞘軸突的再髓鞘化,軸突的再生,最終為脊髓損傷的治療奠定一定的實驗基礎(chǔ)。方法:1.選用出生48小時(hour,h)內(nèi)的SD大鼠,取大腦皮質(zhì)組織,用振蕩分離、差速貼壁等方法分離、純化、培養(yǎng)獲得OPCs。采用免疫細胞化學技術(shù),根據(jù)早期OPCs細胞膜上特異性的表達PDGFR-α,行分離獲得的OPCs鑒定。將OPCs轉(zhuǎn)入定向分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后,根據(jù)OPCs誘導中晚期O4、MBP表達,行少突膠質(zhì)細胞成熟情況的鑒定。2.體外條件下,用CCK-8法檢測OPCs在不同濃度的CXCL12(0ng/m L、5ng/m L、10ng/m L、20ng/m L)培養(yǎng)條件下,在不同時間點(0h、24h、48h、72h)的增殖情況。利用Western blot法檢測OPCs在不同濃度的CXCL12作用72h后下游CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達。3.在20ng/m L的CXCL12培養(yǎng)條件下,選用經(jīng)過篩選后能夠有效干擾OPCs的CXCR4、CXCR7表達的CXCR4 si RNA、CXCR7 si RNA分別干擾CXCR4、CXCR7蛋白表達。用CCK-8檢測各實驗組(CXCL12、CXCL12+con si RNA、CXCL12+CXCR4si RNA、CXCL12+CXCR7 si RNA)OPCs在不同時間點(0h、24h、48h、72h)的增殖情況,用Western blot法檢測OPCs各實驗組條件下作用72h后CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達情況。4.利用經(jīng)過篩選后能夠有效干擾CXCR4、CXCR7下游的MMP9表達的MMP9si RNA干擾MMP9表達,然后CCK-8檢測在20ng/m L的CXCL12條件下OPCs在各時間點(0h、24h、48h、72h)的增殖情況。結(jié)果:1.在原代培養(yǎng)第9-10天,細胞呈明顯分層生長態(tài)勢,利用振蕩分離、差速貼壁方法獲得了大量高純度的OPCs。剛開始細胞胞體較小,直徑6~10μm,近似的呈圓形,為折光性較強的小亮點,有的胞體開始有細小的兩極細胞突起或者三極細胞突起出現(xiàn)。免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示:分離后OPCs能特異性表達PDGFR-α,定向分化培養(yǎng)后,OPCs趨于成熟,周圍纖細突起較未誘導前稍增多,細胞胞體增大,誘導中期O4表達呈陽性,誘導晚期胞體網(wǎng)狀纖細突起更加明顯,呈“樹枝狀”甚至“蜘蛛網(wǎng)狀”分布,MBP表達呈陽性,是成熟的髓鞘形成細胞。2.在一定濃度范圍內(nèi),隨著培養(yǎng)基中CXCL12濃度增加,OPCs增殖作用逐漸增強,CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達量逐漸增加;在一定范圍的培養(yǎng)時間內(nèi),隨著培養(yǎng)時間的延長,OPCs增殖逐漸增強,CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白的表達量逐漸增加。與0ng/m L相比,20ng/m LCXCL12作用72h后,OPCs增殖及CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達增加最明顯(P0.05)。3.用CXCR4 si RNA、CXCR7 si RNA分別干擾CXCR4、CXCR7蛋白表達后,OPCs在各時間點的增殖均逐漸受到抑制,培養(yǎng)72h后差異最顯著(P0.05、P0.05),CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達量逐漸減少,培養(yǎng)72h后差異最顯著(P0.05、P0.01)。4.單獨用MMP9 si RNA干擾MMP9表達后,OPCs增殖同樣受到抑制,增殖作用降低(P0.05)。結(jié)論1.本實驗通過振蕩分離、差速貼壁法分離獲得了實驗所需的原代OPCs,在體外培養(yǎng)條件下可以繼續(xù)存活,分化成熟。2.在一定的濃度和時間范圍內(nèi),CXCL12能夠明顯促進OPCs的增殖,這種促增殖作用與CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達上調(diào)密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2

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本文編號：2353662