【摘要】：第一部分異丙酚對原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元的損傷作用目的:觀察異丙酚不同濃度和不同作用時間對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的損傷作用,倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài),采用MTT法檢測異丙酚對發(fā)育期海馬神經(jīng)元活力的影響;用流式細胞術(shù)測定不同濃度異丙酚作用24h對海馬神經(jīng)元凋亡率的影響;Hoechst33258核染色法觀察不同濃度的異丙酚對發(fā)育期海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)的影響。方法:用原代培養(yǎng)4d左右的海馬神經(jīng)元,分別加入不同濃度的異丙酚1μg/ml、10μg/ml/、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml或60μg/ml異丙酚處理海馬神經(jīng)元6、12、24、48h后,倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài),并用MTT法測定OD值。每次實驗設(shè)定DMSO溶劑對照組。細胞活力=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)。據(jù)MTT實驗篩選結(jié)果,再在4~5d的海馬神經(jīng)元中加入20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的丙泊酚,繼續(xù)培養(yǎng)24h后采用流式細胞術(shù)Anxexin V/PI法測定神經(jīng)元凋亡率。然后再用同樣的方法采用Hoechst33258核染色法驗證不同濃度異丙酚對海馬神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果:1 MTT法檢測結(jié)果顯示異丙酚對海馬神經(jīng)元活力的抑制是有時間和濃度依賴性的(P0.01)。高于或等于20μg/ml濃度的異丙酚在作用時間相同的情況下,隨著濃度的升高,細胞活力顯著下降(P0.01)。60μg/ml異丙酚對海馬神經(jīng)元作用時間超過12h后,隨著時間的延長,細胞活力亦顯著降低(P0.01)。2海馬神經(jīng)元經(jīng)不同濃度的異丙酚處理不同時間后,可以觀察到神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少,細胞體積變小,折光性變差,濃度升高到一定程度(60μg/ml)時,可以觀察到神經(jīng)突起斷裂,甚至部分神經(jīng)元胞體破裂成碎片。3流式細胞術(shù)Anxexin V/PI法檢測細胞凋亡率的結(jié)果表明,20μg/ml異丙酚對凋亡率的影響與對照組無顯著差異,40μg/ml、60μg/ml和80μg/ml濃度對凋亡率的影響與對照組比較有顯著性差異(P0.05,P0.01,P0.01),且凋亡率隨濃度增加而逐漸升高。4 Hoechst33258核染色法觀察不同濃度的異丙酚對發(fā)育期海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)的結(jié)果顯示,染色最終結(jié)果與MTT、流式細胞術(shù)趨勢類似。隨著異丙酚濃度的增加,凋亡神經(jīng)元數(shù)目隨之增多,80μg/ml的異丙酚作用24h后,神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,有部分細胞核裂解為碎塊,出現(xiàn)凋亡小體。結(jié)論:異丙酚呈濃度及時間依賴性的抑制發(fā)育期海馬神經(jīng)元活力。高濃度異丙酚呈濃度依賴性導致發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡率增加。高濃度的異丙酚處理神經(jīng)元,對神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量有明顯影響。第二部分Rho GTP酶在異丙酚對原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元毒性中目的:檢測不同濃度異丙酚對Rho GTPases家族的Rho A,ROCK1,Rac1和PAK1表達水平的影響;觀察Rho激酶特異性抑制劑Y27632對異丙酚導致的發(fā)育期海馬神經(jīng)元損傷的影響。方法:將培養(yǎng)4d的海馬神經(jīng)元分為四組,每組加入不同濃度的異丙酚,異丙酚終濃度分別為0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml,將每組中溶劑DMSO的濃度均調(diào)整為0.04%。加入藥物培養(yǎng)12h后Western blot法檢測各組Rho A,ROCK1,Rac1和PAK1蛋白的表達水平;將原代培養(yǎng)4d的海馬神經(jīng)元分為四組:溶劑對照組(加入相同濃度的DMSO,C組),異丙酚組(終濃度為60μg/ml,P組),異丙酚+Y27632組(異丙酚終濃度為60μg/ml,Y27632終濃度為10μM,P+Y組),Y27632組(終濃度為10μM,Y組),加入藥物后培養(yǎng)24h,采用MTT法測定各組海馬神經(jīng)元的存活率,流式細胞術(shù)Anxexin V/PI法檢測各組細胞凋亡率,Western blot法檢測各組海馬神經(jīng)元cleaved-Caspase-3的表達驗證流式細胞術(shù)的結(jié)果。結(jié)果:1 Western blot法檢測不同濃度異丙酚對海馬神經(jīng)元Rho A,ROCK1,Rac1和PAK1表達水平的結(jié)果顯示,異丙酚處理20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml組中Rho A表達水平呈濃度依賴性升高,且與對照組比較有顯著性差異(P0.05,P0.01,P0.01);異丙酚處理20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml組中ROCK1表達水平亦呈濃度依賴性升高,且與對照組比較有顯著性差異(P0.05,P0.01,P0.01);不同濃度異丙酚處理后,Rac1的表達水平雖然隨異丙酚濃度升高而降低,但與對照組比較均無顯著性差異;與對照組比較,PAK1的表達水平隨異丙酚處理濃度的升高而顯著降低(P0.01)。2 MTT法檢測Y27632對異丙酚所致發(fā)育期海馬神經(jīng)元活力的影響結(jié)果顯示,與對照組比較,異丙酚組神經(jīng)元活力顯著下降(P0.01),Y27632單獨處理組神經(jīng)元活力無統(tǒng)計學差異;與P組比較,Y27632與異丙酚共處理24h后神經(jīng)元的活力顯著升高(P0.01)。3 Anxexin V/PI雙染法檢測Y27632對異丙酚導致的發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡的影響,結(jié)果顯示對照組(C組)與Y27632單獨處理組(Y組)僅有少量神經(jīng)元凋亡,兩組之間比較凋亡率無統(tǒng)計學差異,異丙酚組(P組)神經(jīng)元凋亡率較對照組有顯著增加(P0.01),Y27632可使異丙酚導致的神經(jīng)元凋亡顯著降低(P0.01)。4 Western blot法檢測發(fā)育期海馬神經(jīng)元cleaved-Caspase-3的表達,結(jié)果顯示,與對照組(C組)比較,Y27632單獨處理組(Y組)cleaved-Caspase-3的表達量無統(tǒng)計學差異,異丙酚組(P組)神經(jīng)元cleaved-Caspase-3的表達量比C組顯著增加(P0.01),與P組比較,Y27632與異丙酚共處理組(P+Y組)神經(jīng)元的cleaved-Caspase-3的表達量有所降低(P0.05),說明異丙酚處理可以導致神經(jīng)元凋亡率升高,此結(jié)果與流式細胞術(shù)結(jié)果趨勢一致。結(jié)論:異丙酚能夠增加Rho A和ROCK1的表達水平,降低PAK1的表達水平。抑制Rho激酶通路(Rho/ROCK)的活性可以減輕異丙酚對發(fā)育期海馬神經(jīng)元的損傷作用。Rho激酶通路的激活可能是異丙酚造成發(fā)育期神經(jīng)元損傷的機制之一。第三部分異丙酚對發(fā)育期SD幼鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡和遠期學習記憶功目的:用連續(xù)7d的腹腔異丙酚注射方式,對處于大腦快速發(fā)育期的7日齡SD乳鼠進行處理,觀察海馬神經(jīng)細胞的凋亡情況及成年后大鼠學習記憶功能有無改變。方法:七日齡SD大鼠69只,隨機分為三組,每組23只,異丙酚組(P組)腹腔注射異丙酚50mg/kg;溶劑對照組(S組)腹腔注射等容量脂肪乳5ml/kg;空白對照組(C組)腹腔注射等容量生理鹽水,腹腔注射連續(xù)7d,每天1次,麻醉后將幼鼠放入恒溫孵育箱中并持續(xù)低流量吸氧,麻醉過程中觀察幼鼠皮膚顏色變化,翻正反射恢復后放回母鼠身邊,與母鼠分離時間不超過5h,各組隨機取5只測定血糖及血氧飽和度,隨機取3只用尼氏染色(Nissl staining)觀察神經(jīng)元損傷情況,5只TUNEL法檢測大鼠海馬CA1、CA3及齒狀回區(qū)神經(jīng)細胞凋亡情況的影響,5只用caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3酶活性變化,各組剩余10只飼養(yǎng)至60d成年后用Morris水迷宮測試成年后大鼠學習記憶功能有無改變。結(jié)果:1各組大鼠血糖值和血氧飽和度均在正常范圍內(nèi),無顯著性差異(P0.05)。2 Nissl染色發(fā)現(xiàn)對照組C組和溶劑對照組S組各區(qū)均無明顯差別,未見神經(jīng)細胞缺失,海馬神經(jīng)細胞形態(tài)正常。與C組相比,P組幼鼠在海馬CA1區(qū)可見部分神經(jīng)細胞缺失,細胞形態(tài)亦欠完整,胞漿內(nèi)尼氏體減少,神經(jīng)元數(shù)量減少,P組CA3及齒狀回區(qū)細胞形態(tài)偶可見細胞形態(tài)異常及著色減淺,但細胞缺失不明顯。3 TUNEL法發(fā)現(xiàn),與C組比較,S組各區(qū)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量無顯著差異,P組CA1區(qū)及CA3區(qū)的凋亡細胞數(shù)量較C組明顯升高(P0.01,P0.05),P組齒狀回區(qū)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量與C組比較無統(tǒng)計學差異,說明異丙酚處理可以使大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率升高。4 Caspase-3活性檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn),與空白組C組比較,異丙酚處理組P組caspase-3的活性顯著升高(P0.01),而脂肪乳溶劑對照組S組與C組之間無顯著性差異,各組總體趨勢與TUNEL法檢測結(jié)果一致。5在5d的訓練期內(nèi),前3d各組大鼠逃逸潛伏期未見統(tǒng)計學差異。第4d和第5d,P組與對照組C組的逃逸潛伏期有統(tǒng)計學差異(P0.01)。溶劑對照組S組與C組相比在在5d的訓練期內(nèi)都無統(tǒng)計學差異。第6d空間探索實驗中,P組與C組比較,其穿臺次數(shù)明顯減少(P0.01),S組與C組比較,穿臺次數(shù)無統(tǒng)計學差異。結(jié)果表明異丙酚可以影響大鼠的學習記憶能力。結(jié)論:連續(xù)7d給予7日齡SD幼鼠腹腔注射異丙酚可致海馬神經(jīng)細胞損傷,凋亡增加,成年后學習記憶能力受損。第四部分鹽酸法舒地爾對異丙酚引起的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的保護作用及其機制研究目的:觀察鹽酸法舒地爾是否對異丙酚導致的海馬神經(jīng)細胞凋亡有無保護作用,以及p38MAPK信號通路在其中的作用,為臨床防治異丙酚的發(fā)育期神經(jīng)毒性提供實驗依據(jù)。方法:健康七日齡SD大鼠72只,隨機分為四組,每組18只,異丙酚組(P組)腹腔注射異丙酚50mg/kg;鹽酸法舒地爾+異丙酚組(PF組)腹腔注射鹽酸法舒地爾10mg/kg+異丙酚50mg/kg;鹽酸法舒地爾組(F組)腹腔注射鹽酸法舒地爾10mg/kg;空白對照組(C組)腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射連續(xù)7d,每天1次,注藥后待翻正反射消失,將幼鼠放入恒溫孵育箱中并持續(xù)低流量吸氧,翻正反射恢復后放回母鼠身邊,與母鼠分離時間不超過5h。各組隨機選5只幼鼠檢測血糖及血氧飽和度,TUNEL法各組隨機選取5只檢測幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡情況,各組隨機選3只采用Western blot檢測p38MAPK,p-p38MAPK,Bcl-2及Cleaved-caspase-3蛋白表達的變化,各組剩余10只飼養(yǎng)至生后60d用Morris水迷宮測試SD幼鼠成年后的空間學習記憶能力。結(jié)果:1 TUNEL法檢測各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的結(jié)果顯示,同C組相比,F組凋亡細胞凋亡細胞數(shù)量無統(tǒng)計學差異,P組的凋亡細胞數(shù)量較C組明顯升高(P0.01),PF組凋亡細胞數(shù)量比P組顯著減少(P0.01),說明異丙酚可使海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡增加,而鹽酸法舒地爾對這種凋亡增加具有保護作用。2 Western blot法檢測結(jié)果顯示,p38MAPK表達水平:與C組比較,P組表達水平無統(tǒng)計學差異(P=0.105),F組表達水平明顯降低(P0.05),與P組比較,PF組表達量無明顯差異(P=0.150);p-p38MAPK表達水平:與C組相比,P組表達水平明顯升高(P0.01),F組表達水平降低(P0.05),與P組比較,PF組表達水平明顯降低;各組Bcl-2表達水平:與C組相比,P組表達水平明顯降低(P0.01),F組表達水平升高(P0.05),與P組相比,PF組表達水平明顯升高(P0.01);活化的caspase-3蛋白表達水平:與C組相比,P組表達明顯升高(P0.01),F組表達無明顯差異,與P組比較,PF組表達明顯降低(P0.01),說明異丙酚可使海馬神經(jīng)細胞凋亡增加,而鹽酸法舒地爾可使凋亡減少,此結(jié)果驗證了TUNEL檢測各組凋亡的結(jié)果。3在5d的訓練期內(nèi),前3d各組大鼠逃逸潛伏期未見統(tǒng)計學差異,第4d和第5d,與C組相比,P組逃逸潛伏期都明顯延長(P0.01),這與本論文第三部分結(jié)果一致,F組逃逸潛伏期與C組均無統(tǒng)計學差異,與P組相比,PF組逃逸潛伏期均明顯縮短(P0.05);第6d的空間探索實驗,P組與C組比較,其穿臺次數(shù)明顯減少,有統(tǒng)計學差異(P0.01),F組與C組比較,穿臺次數(shù)無統(tǒng)計學差異,與P組比較,PF組穿臺次數(shù)明顯增多(P0.05)。結(jié)果說明鹽酸法舒地爾對異丙酚造成的大鼠學習記憶損害具有保護作用。結(jié)論:鹽酸法舒地爾可以對異丙酚導致的幼鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡產(chǎn)生保護作用。異丙酚可以激活p38MAPK信號通路,此通路的抑制是鹽酸法舒地爾對異丙酚發(fā)育期神經(jīng)細胞損傷保護作用的機制之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614
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本文編號：
2346545
