【摘要】：研究背景及目的:對(duì)于許多實(shí)體器官終末期疾病及腫瘤、血液疾病來說,器官移植或者造血干細(xì)胞移植已成為一種重要的治療手段。隨著免疫抑制劑的發(fā)明和廣泛應(yīng)用,大部分移植排斥反應(yīng)得到了有效控制,移植物的長(zhǎng)期存活率得到了明顯提升。但仍有相當(dāng)一部分移植排斥反應(yīng)控制效果不佳,導(dǎo)致移植物功能障礙或衰竭,嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致二次移植或者宿主死亡。因此,關(guān)于移植排斥反應(yīng)的研究仍在如火如荼的進(jìn)行中。急性移植排斥反應(yīng)是同種異體器官移植中最常見的一類排斥反應(yīng),一般多于移植術(shù)后數(shù)天至兩周左右出現(xiàn),80-90%發(fā)生于術(shù)后一個(gè)月內(nèi),也有相當(dāng)一部分受者在移植術(shù)后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)反復(fù)發(fā)作。而T細(xì)胞免疫應(yīng)答在移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用乃是全世界公認(rèn)的事實(shí)。其中,在急性移植排斥反應(yīng)中,CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)是主要的損傷機(jī)制。T細(xì)胞可通過直接識(shí)別和間接識(shí)別對(duì)同種異型抗原進(jìn)行識(shí)別。移植物中的過客白細(xì)胞(passenger leukocytes,主要為成熟的DC和巨噬細(xì)胞等APC)可進(jìn)入受體的血液循環(huán)及淋巴組織,在外周淋巴組織與外周淋巴器官中(主要是淋巴結(jié)和脾臟)與受體的T細(xì)胞接觸后可通過直接識(shí)別(direct recognition)將同種移植抗原直接遞呈給受體T細(xì)胞,以快速活化T淋巴細(xì)胞;或通過間接識(shí)別(indirect recognition)的方式將同種MHC抗原提呈給受體T細(xì)胞,介導(dǎo)T細(xì)胞活化的免疫應(yīng)答過程,產(chǎn)生機(jī)體針對(duì)移植物的移植排斥反應(yīng)。器官移植后的免疫應(yīng)答過程復(fù)雜,不同的免疫細(xì)胞及其亞群的活化、細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用及其信號(hào)調(diào)控、分泌的細(xì)胞因子以及神經(jīng)-內(nèi)分泌均在移植排斥反應(yīng)的產(chǎn)生中發(fā)揮調(diào)控作用,包括(1)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是近年來認(rèn)識(shí)的發(fā)揮重要調(diào)控作用的細(xì)胞。研究表明,CD4+CD25+Treg可通過細(xì)胞直接接觸(包括CTLA-4、PDL-1等分子結(jié)合)的方式,調(diào)控T細(xì)胞的增殖,并可下調(diào)共刺激分子,抑制T細(xì)胞活化。(2)細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞的調(diào)控。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞大體上可分為CD4+CD25+Tr細(xì)胞、Tr1細(xì)胞、Th3細(xì)胞等亞型。CD4+Th2細(xì)胞活化后可分泌IL-10,誘導(dǎo)Tr1細(xì)胞生成,Tr1細(xì)胞活化后也可分泌IL-10。而Th3細(xì)胞分泌TGF-β,則對(duì)CD4+Th1、Th2都有抑制作用。(3)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化。有研究表明,GH缺陷時(shí)CD4+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞減少,GH還影響胸腺細(xì)胞的遷移和釋放。體外注射T3則能增加CD44+胸腺細(xì)胞的數(shù)量。生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor,GHSR),也是胃饑餓素的受體,首先是作為生長(zhǎng)激素促分泌素(growth hormone secretagogue,GHS)的靶受體被發(fā)現(xiàn),隨即在人類腦垂體和下丘腦中發(fā)現(xiàn)其存在。Zigman JM等發(fā)現(xiàn)GHSR在中樞和外周組織中均有廣泛表達(dá)。GHSR的生理功能包括:(1)與多種激素的釋放有關(guān),如生長(zhǎng)激素,促腎上腺皮質(zhì)激素,皮質(zhì)醇,催乳素;(2)調(diào)節(jié)食物攝入和能量代謝;(3)影響血糖和血脂代謝;(4)調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)和分泌和胰腺功能;(5)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活;(6)在衰減促炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和調(diào)節(jié)老化和胃腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的免疫功能作用;(7)保護(hù)神經(jīng)和心血管系統(tǒng)。但是,GHSR是否在移植排斥的產(chǎn)生和調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用,目前尚未有相關(guān)研究的報(bào)道。基于此,本研究在通過構(gòu)建GHSR缺陷小鼠,研究GHSR在不同免疫細(xì)胞中的表達(dá),探討GHSR對(duì)免疫細(xì)胞增殖的影響。在建立小鼠心臟同種異體異位移植模型的基礎(chǔ)上,研究GHSR在急性移植排斥中的作用及體內(nèi)細(xì)胞與分子機(jī)制。為GHSR闡述GHSR在同種移植排斥的作用、更有效的防治移植排斥反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。第一部分:小鼠頸部心臟同種異體移植模型的建立及GHSR在急性移植排斥反應(yīng)中的作用目的:建立小鼠頸部心臟同種異體移植后急性排斥反應(yīng)模型并研究GHSR在急性移植排斥反應(yīng)中的作用。方法:1)、選取6周齡的體重、性別相匹配的Balb/c小鼠作為供體,8周齡的體重、性別相匹配的GHSR-/-(實(shí)驗(yàn)組)和C57BL/6(對(duì)照組)小鼠作為受體,行頸部異位心臟移植術(shù)。2)、觀察其移植物生存期。3)、術(shù)后第5天取移植物行病理檢查(HE染色)。4)、用RT-PCR檢測(cè)術(shù)后移植物中炎癥因子IL-1、6、17、TNF-a的m RNA表達(dá)的變化。5)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)術(shù)后受體小鼠脾臟、淋巴結(jié)中T細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果:GHSR缺陷可明顯延長(zhǎng)移植物生存期;HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等較對(duì)照組明顯減輕;實(shí)驗(yàn)組小鼠移植后移植物各炎癥因子的表達(dá)均低于對(duì)照組;其脾臟及淋巴結(jié)內(nèi)的CD4+T細(xì)胞比例也低于較對(duì)照組,Treg細(xì)胞比例均高于對(duì)照組。結(jié)論:GHSR缺陷后可減輕急性移植排斥反應(yīng),對(duì)移植物發(fā)揮保護(hù)作用。第二部分:GHSR在同種器官移植急性排斥反應(yīng)中的細(xì)胞分子機(jī)制研究目的:研究GHSR在急性移植排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。方法:1)、免疫組化分析移植物中浸潤(rùn)的細(xì)胞種類。2)、RT-PCR檢測(cè)移植物中細(xì)胞表面分子m RNA的表達(dá);3)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)兩組小鼠T細(xì)胞增值能力的變化。4)、Western-blot檢測(cè)T細(xì)胞激活通路中NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的變化。5)、Western-blot檢測(cè)NF-AT、AP-1、Foxp3蛋白的變化。結(jié)果:免疫組化顯示移植物的浸潤(rùn)細(xì)胞以T細(xì)胞為主,但GHSR缺陷的小鼠的T細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組;GHSR缺陷小鼠的T細(xì)胞增值能力較C57BL/6小鼠減弱;實(shí)驗(yàn)組小鼠移植后NF-κB通路中ZAP-70、IKKβ、p65蛋白活化均低于對(duì)照組;在GHSR缺陷的小鼠中,由于NF-AT和AP-1表達(dá)增加,上調(diào)了Foxp3的表達(dá),使Treg比例增加。結(jié)論:GHSR可通過影響T細(xì)胞增殖、分化、活化等功能在移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R617

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本文編號(hào)：2271198