【摘要】：研究背景及目的:對于許多實體器官終末期疾病及腫瘤、血液疾病來說,器官移植或者造血干細胞移植已成為一種重要的治療手段。隨著免疫抑制劑的發(fā)明和廣泛應用,大部分移植排斥反應得到了有效控制,移植物的長期存活率得到了明顯提升。但仍有相當一部分移植排斥反應控制效果不佳,導致移植物功能障礙或衰竭,嚴重者甚至導致二次移植或者宿主死亡。因此,關(guān)于移植排斥反應的研究仍在如火如荼的進行中。急性移植排斥反應是同種異體器官移植中最常見的一類排斥反應,一般多于移植術(shù)后數(shù)天至兩周左右出現(xiàn),80-90%發(fā)生于術(shù)后一個月內(nèi),也有相當一部分受者在移植術(shù)后相當長一段時間內(nèi)反復發(fā)作。而T細胞免疫應答在移植排斥反應中發(fā)揮重要作用乃是全世界公認的事實。其中,在急性移植排斥反應中,CD4+T細胞介導的遲發(fā)型超敏反應是主要的損傷機制。T細胞可通過直接識別和間接識別對同種異型抗原進行識別。移植物中的過客白細胞(passenger leukocytes,主要為成熟的DC和巨噬細胞等APC)可進入受體的血液循環(huán)及淋巴組織,在外周淋巴組織與外周淋巴器官中(主要是淋巴結(jié)和脾臟)與受體的T細胞接觸后可通過直接識別(direct recognition)將同種移植抗原直接遞呈給受體T細胞,以快速活化T淋巴細胞;或通過間接識別(indirect recognition)的方式將同種MHC抗原提呈給受體T細胞,介導T細胞活化的免疫應答過程,產(chǎn)生機體針對移植物的移植排斥反應。器官移植后的免疫應答過程復雜,不同的免疫細胞及其亞群的活化、細胞與細胞的相互作用及其信號調(diào)控、分泌的細胞因子以及神經(jīng)-內(nèi)分泌均在移植排斥反應的產(chǎn)生中發(fā)揮調(diào)控作用,包括(1)細胞與細胞之間的相互作用。調(diào)節(jié)性T細胞是近年來認識的發(fā)揮重要調(diào)控作用的細胞。研究表明,CD4+CD25+Treg可通過細胞直接接觸(包括CTLA-4、PDL-1等分子結(jié)合)的方式,調(diào)控T細胞的增殖,并可下調(diào)共刺激分子,抑制T細胞活化。(2)細胞因子對細胞的調(diào)控。調(diào)節(jié)性T細胞大體上可分為CD4+CD25+Tr細胞、Tr1細胞、Th3細胞等亞型。CD4+Th2細胞活化后可分泌IL-10,誘導Tr1細胞生成,Tr1細胞活化后也可分泌IL-10。而Th3細胞分泌TGF-β,則對CD4+Th1、Th2都有抑制作用。(3)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)T細胞的分化。有研究表明,GH缺陷時CD4+CD8+雙陽性胸腺細胞減少,GH還影響胸腺細胞的遷移和釋放。體外注射T3則能增加CD44+胸腺細胞的數(shù)量。生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor,GHSR),也是胃饑餓素的受體,首先是作為生長激素促分泌素(growth hormone secretagogue,GHS)的靶受體被發(fā)現(xiàn),隨即在人類腦垂體和下丘腦中發(fā)現(xiàn)其存在。Zigman JM等發(fā)現(xiàn)GHSR在中樞和外周組織中均有廣泛表達。GHSR的生理功能包括:(1)與多種激素的釋放有關(guān),如生長激素,促腎上腺皮質(zhì)激素,皮質(zhì)醇,催乳素;(2)調(diào)節(jié)食物攝入和能量代謝;(3)影響血糖和血脂代謝;(4)調(diào)節(jié)胃腸運動和分泌和胰腺功能;(5)調(diào)節(jié)細胞增殖和存活;(6)在衰減促炎癥級聯(lián)反應和調(diào)節(jié)老化和胃腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的免疫功能作用;(7)保護神經(jīng)和心血管系統(tǒng)。但是,GHSR是否在移植排斥的產(chǎn)生和調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用,目前尚未有相關(guān)研究的報道�；诖�,本研究在通過構(gòu)建GHSR缺陷小鼠,研究GHSR在不同免疫細胞中的表達,探討GHSR對免疫細胞增殖的影響。在建立小鼠心臟同種異體異位移植模型的基礎上,研究GHSR在急性移植排斥中的作用及體內(nèi)細胞與分子機制。為GHSR闡述GHSR在同種移植排斥的作用、更有效的防治移植排斥反應提供實驗數(shù)據(jù)。第一部分:小鼠頸部心臟同種異體移植模型的建立及GHSR在急性移植排斥反應中的作用目的:建立小鼠頸部心臟同種異體移植后急性排斥反應模型并研究GHSR在急性移植排斥反應中的作用。方法:1)、選取6周齡的體重、性別相匹配的Balb/c小鼠作為供體,8周齡的體重、性別相匹配的GHSR-/-(實驗組)和C57BL/6(對照組)小鼠作為受體,行頸部異位心臟移植術(shù)。2)、觀察其移植物生存期。3)、術(shù)后第5天取移植物行病理檢查(HE染色)。4)、用RT-PCR檢測術(shù)后移植物中炎癥因子IL-1、6、17、TNF-a的m RNA表達的變化。5)、流式細胞術(shù)檢測術(shù)后受體小鼠脾臟、淋巴結(jié)中T細胞亞群的變化。結(jié)果:GHSR缺陷可明顯延長移植物生存期;HE染色顯示實驗組小鼠心肌細胞水腫、壞死、炎癥細胞浸潤等較對照組明顯減輕;實驗組小鼠移植后移植物各炎癥因子的表達均低于對照組;其脾臟及淋巴結(jié)內(nèi)的CD4+T細胞比例也低于較對照組,Treg細胞比例均高于對照組。結(jié)論:GHSR缺陷后可減輕急性移植排斥反應,對移植物發(fā)揮保護作用。第二部分:GHSR在同種器官移植急性排斥反應中的細胞分子機制研究目的:研究GHSR在急性移植排斥反應中的作用機制。方法:1)、免疫組化分析移植物中浸潤的細胞種類。2)、RT-PCR檢測移植物中細胞表面分子m RNA的表達;3)、混合淋巴細胞反應檢測兩組小鼠T細胞增值能力的變化。4)、Western-blot檢測T細胞激活通路中NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的變化。5)、Western-blot檢測NF-AT、AP-1、Foxp3蛋白的變化。結(jié)果:免疫組化顯示移植物的浸潤細胞以T細胞為主,但GHSR缺陷的小鼠的T細胞數(shù)量明顯低于對照組;GHSR缺陷小鼠的T細胞增值能力較C57BL/6小鼠減弱;實驗組小鼠移植后NF-κB通路中ZAP-70、IKKβ、p65蛋白活化均低于對照組;在GHSR缺陷的小鼠中,由于NF-AT和AP-1表達增加,上調(diào)了Foxp3的表達,使Treg比例增加。結(jié)論:GHSR可通過影響T細胞增殖、分化、活化等功能在移植排斥反應中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R617

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本文編號：2271197