【摘要】：目的:建立兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)采用全骨髓法體外分離,檢測其生物學(xué)特性和多向誘導(dǎo)分化特征,并觀察其對細(xì)胞形態(tài)和增殖性能的影響。制備透明質(zhì)酸水凝膠,檢測其生物相容性和抗降解能力。通過構(gòu)建兔股骨中下段缺損模型,以濃縮骨髓血液、HA冷凍解凍水凝膠和異體骨條作為內(nèi)植物修復(fù)兔骨缺損,探討生物水凝膠體系修復(fù)兔股骨中下段缺損的效果。方法:(1)采用全骨髓貼壁細(xì)胞分離法提取純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs;(2)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面特異性受體表達(dá),進(jìn)行鑒定,并且在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化,采用特異性染色并觀察其結(jié)果;(3)采用冷凍解凍成膠的方法制備透明質(zhì)酸(HA)水凝膠,將BMSCs種植于HA水凝膠后通過觀察其中的細(xì)胞形態(tài)分布來檢測HA水凝膠的生物相容性,采用體外降解和動物體內(nèi)包埋的方式檢測其抗降解能力;(4)實驗動物40只,其中4只分為2組作為造模位置選擇的研究,分別在右側(cè)橈骨和股骨中下段造成相同面積的缺損,其余36只隨機(jī)分為4組,建立股骨缺損創(chuàng)傷模型;濃縮骨髓血液和制備HA水凝膠備用;A組植入生物水凝膠體系,B組植入異體骨-HA水凝膠復(fù)合物,C組單純植入異體骨,D組植入自體髂骨。術(shù)后通過X線和大體標(biāo)本骨檢測修復(fù)效果,并且將修復(fù)區(qū)制作切片和HE染色觀察微觀成骨效果。結(jié)果:(1)體外培養(yǎng)的原代BMSCs接種1d開始貼壁,形態(tài)呈長梭形或類圓形;8d-9d后可首次傳代;(2)獲得的細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原CD29、CD44、CD90,不表達(dá)CD45、CD34,證明為間充質(zhì)干細(xì)胞;(3)BMSCs在三種誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下,經(jīng)過21d的增殖分化,分別可被茜素紅、番紅O和油紅O染色,證明獲得三種成體細(xì)胞;(4)造模動物一月后X線顯示兔股骨中下段自身的修復(fù)能力更弱,適合造模;(5)內(nèi)置材料的動物術(shù)后X線結(jié)果顯示:4weeks A組缺損面積減小,24weeks A組和D組完整修復(fù)骨缺損,B、C兩組骨修復(fù)區(qū)與正常骨骨質(zhì)界限清晰,修復(fù)面積未達(dá)到完整結(jié)果;大體標(biāo)本觀察結(jié)果與X線結(jié)果一致;切片HE染色顯示4weeks時A、B、D三組觀察到缺損區(qū)單側(cè)骨膜形成,8weeks只有A組具備完整性內(nèi)外骨膜連續(xù)性的動物,A、D組優(yōu)于B、C組,24weeks A、D組修復(fù)區(qū)與正常骨質(zhì)無差別,未見與正常骨質(zhì)界限,而B、C組則修復(fù)較差。結(jié)論:應(yīng)用全骨髓貼壁法可以獲得純度較高、增殖能力強(qiáng)、表型穩(wěn)定均一、具備多向分化的能力的BMSCs;冷凍解凍成膠法制備的透明質(zhì)酸水凝膠可作為一種無細(xì)胞毒性的三維細(xì)胞支架材料,具備一定的抗降解能力;股骨中下段可作為骨缺損造模的選擇,濃縮骨髓-HA水凝膠-異體骨合成的生物水凝膠體系對于骨缺損的修復(fù)有積極作用,可促進(jìn)早期組織再生和血管再通,是一項臨床應(yīng)用潛力的新技術(shù)。
[Abstract]:Aim: to establish rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) isolated by whole bone marrow method in vitro, to detect the biological characteristics and multidirectional differentiation characteristics, and to observe its effects on the morphology and proliferation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Hyaluronic acid hydrogel was prepared and its biocompatibility and anti-degradation ability were tested. A rabbit model of middle and lower femur defect was established. The bone defects were repaired with concentrated bone marrow hemoglobin freezing and thawing hydrogel and allogeneic bone strips as implants, and the effect of biological hydrogel system on repairing rabbit femur middle and lower segment defect was discussed. Methods: (1) Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated and purified by whole bone marrow adherent cells. BMSCs were cultured in 10% fetal bovine serum culture medium. (2) the expression of specific receptors on cell surface was detected by flow cytometry. In addition, osteoblasts, chondroblasts and adipocytes were differentiated into osteoblasts, chondroblasts and adipocytes in different culture medium. (3) Hyaluronic acid (HA) hydrogel was prepared by freezing and thawing gelation. The biocompatibility of HA hydrogels was detected by observing the morphological distribution of HA hydrogels, and the anti-degradation ability of HA hydrogels was tested by in vitro degradation and in vivo embedding of BMSCs. (4) 40 experimental animals were used to study the biocompatibility of HA hydrogels. Four of them were divided into 2 groups to select the location of the model. The same area of defect was created in the right radius and the middle and lower femur, and the other 36 were randomly divided into 4 groups to establish the model of femoral defect trauma. Bone marrow blood was concentrated and HA hydrogel was prepared. Group A was implanted with biological hydrogel system. Group B was implanted with allogeneic bone and HA hydrogel complex. Group C was implanted with allogeneic bone only. Group D was implanted with autogenous iliac bone. The effect of bone repair was detected by X-ray and gross bone after operation, and the microscopic osteogenic effect was observed by making sections of repair area and HE staining. Results: (1) the primary BMSCs inoculated in vitro began to adhere to the wall 1 day after inoculation. (2) the surface antigen CD29, CD44, CD90, not CD45, CD34, was proved to be mesenchymal stem cells. (3) BMSCs was induced by three kinds of inducers and differentiated after 21 days. It was proved that three kinds of adult cells were obtained by alizarin red, phannin O and oil red O, respectively. (4) X-ray showed that the repair ability of rabbit femur was weaker after 1 month. The results of X-ray showed that the defect area of group A and group D were reduced and the boundary between bone repair area and normal bone in group A and group D were clear, and the area of repair was not up to the complete result. The results were as follows: (1) the results of X-ray showed that the defect area of group A was less than that of group A, and that of group B (group D) was significantly lower than that of group B (P < 0.05). The results of gross specimen observation were consistent with those of X-ray. Section HE staining showed that only A group A with complete internal and external periosteum continuity was found to have no difference between the repair area and the normal bone in group A and B C group during 4weeks, and there was no significant difference between the repair area and the normal bone in the group A and B C, and there was no difference between group A and B C, and no difference was found between the repair area and the normal bone in the group A and B C, and there was no significant difference between the repair area and the normal bone in group A. In group C, the repair was poor. Conclusion: the whole bone marrow adherent method can obtain high purity, strong proliferative ability, stable and uniform phenotype. BMSCs with multi-differentiation ability; hyaluronic acid hydrogel prepared by freezing and thawing gelation method can be used as a non-cytotoxic three-dimensional cell scaffold material with certain anti-degradation ability; the middle and lower femur can be used as a choice for modeling bone defect. The biomedical hydrogel system which concentrates bone marrow hydrogel and allograft bone synthesis has a positive effect on the repair of bone defect and can promote early tissue regeneration and vascular recanalization. It is a potential new technique for clinical application.
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R68

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王瑋;李世杰;高立霞;李慎旺;;骨骼數(shù)據(jù)提取及造型研究[J];河北工業(yè)大學(xué)學(xué)報;2006年05期

2 薛淼,孫志林,陳世浩,陳德敏,葉莉明,徐開堯;兔股骨應(yīng)變的體內(nèi)遙測方法初探[J];中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報;1990年03期

3 吳洪娟,郭文君,王亦進(jìn),黃文波,李連忠;激素誘發(fā)兔股骨頭壞死的組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2003年01期

4 張子軍，盧世壁，林振福;放射性生物微球技術(shù)測量兔股骨區(qū)域性血流量[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;1994年01期

5 宋雅偉;張曦元;;不同時間與負(fù)荷訓(xùn)練對兔股骨壓縮性能的影響[J];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2011年08期

6 陸維舉,李斌,趙建寧,曾曉峰,時寧文,朱虹,王強(qiáng);滋養(yǎng)動脈結(jié)扎對兔股骨血供的影響[J];中國骨傷;2001年09期

7 楊述華,楊操,許偉華,李進(jìn),張銀剛;液氮冷凍建立兔股骨頭缺血性壞死模型[J];中國矯形外科雜志;2001年01期

8 王永剛,裴國獻(xiàn),張洪濤,張元平,王學(xué)明;兔股骨干缺損模型的制備及在組織工程骨實驗中的應(yīng)用[J];中華創(chuàng)傷骨科雜志;2005年10期

9 楊淵;李小峰;羅道明;溫超海;;柚皮甙誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔股骨頭壞死[J];中國組織工程研究;2012年49期

10 余開湖,馮敢生,鄭傳勝,梁惠民,杜玉清,邱大勝;激素性兔股骨頭缺血性壞死模型的實驗研究[J];中華放射學(xué)雜志;2005年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 孔春元;迪麗娜爾·馬合木提;衛(wèi)榮;;沙療對關(guān)節(jié)炎兔股骨力學(xué)性能影響的試驗研究[A];第十屆中國科協(xié)年會論文集（一）[C];2008年

2 高根德;李明亮;;體外沖擊波治療家兔股骨頭壞死的實驗研究[A];第四屆全國康復(fù)治療學(xué)術(shù)大會論文摘要匯編[C];2004年

3 高根德;李明亮;;體外沖擊波治療家兔股骨頭壞死的實驗研究[A];2008年浙江省物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)術(shù)年會暨中樞神經(jīng)功能損傷康復(fù)新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2008年

4 鮮蘇琴;;類骨質(zhì)羥基磷灰石植入兔股骨缺損的實驗研究[A];第四屆全國口腔種植學(xué)術(shù)會議論文集[C];2005年

5 楊淵;林春博;李小峰;羅道明;;柚皮甙誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔股骨頭壞死的實驗研究[A];第十八屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

6 張戰(zhàn)和;江玉民;歐俊;;rhBMP-2 & 20%-β-TCP/SF復(fù)合物植入兔股骨缺損的實驗研究[A];第十八屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

7 王蕭楓;吳銀生;王利明;毛強(qiáng);金紅婷;;激素法與液氮法在兔股骨頭壞死造模中的應(yīng)用比較研究[A];2012年浙江省中醫(yī)藥學(xué)會博士學(xué)術(shù)研究分會學(xué)術(shù)年會暨“中醫(yī)藥臨床科研方法學(xué)培訓(xùn)班”論文集[C];2012年

8 徐志彥;;《細(xì)胞分化》教學(xué)案例(教學(xué)內(nèi)容安排1課時)[A];河北省教師教育學(xué)會第二屆中小學(xué)教師教學(xué)案例展論文集[C];2013年

9 尹青;張雷;李莉;謝丹丹;龔淼;;體外心肌樣環(huán)境對P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用[A];中國解剖學(xué)會2012年年會論文文摘匯編[C];2012年

10 吳瑞坤;康萬利;吳曉燕;范海明;戴彩麗;馮其紅;;適于北布扎奇油田的聚合物弱凝膠體系研究[A];中國流變學(xué)研究進(jìn)展（2010）[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 徐榮祥;人類生命細(xì)胞 再生物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與研究[N];健康報;2007年

2 張佳星;干細(xì)胞分化路徑存在差異性[N];中國礦業(yè)報;2008年

3 史軍;剝開黏合的細(xì)胞之書[N];健康報;2012年

4 常麗君;美生物學(xué)家打造出“細(xì)胞黑客”[N];科技日報;2010年

5 張佳星;分化之路 殊途同歸[N];科技日報;2008年

6 記者 施嘉奇　通訊員 王姿英;探索中藥對干細(xì)胞分化的作用[N];文匯報;2009年

7 記者陳超;日開發(fā)細(xì)胞間隔離培養(yǎng)技術(shù)[N];科技日報;2003年

8 陳超;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)引發(fā)細(xì)胞分化的分子通道[N];科技日報;2010年

9 記者 白毅;我國科學(xué)家用iPS細(xì)胞首獲克隆豬[N];中國醫(yī)藥報;2013年

10 記者 錢錚;日本用人類iPS細(xì)胞首次制成血小板[N];新華每日電訊;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周密;肝細(xì)胞生長因子修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療兔股骨頭壞死的實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2009年

2 賈羽潔;聚苯胺—聚對苯乙烯磺酸水凝膠基活性炭的制備與應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2017年

3 楊伯光;聚噻吩基導(dǎo)電水凝膠研制及其在心肌組織工程中的應(yīng)用研究[D];天津大學(xué);2016年

4 郭新紅;2-甲氧基雌二醇脂質(zhì)納米粒水凝膠的研究[D];沈陽藥科大學(xué);2012年

5 艾克熱木.牙生;基于不同相互作用的形狀記憶水凝膠的設(shè)計和性能表征[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2017年

6 李彩霞;BMP-7 siRNA對UVECs與BMSCs共培養(yǎng)體系植入后體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

7 高利龍;多官能度聚乙二醇衍生物的合成、凝膠化及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2016年

8 唐紹燦;IL-27、Th1及Th17細(xì)胞在MS中的表達(dá)及其作用機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

9 常凱凱;子宮內(nèi)膜異位灶微環(huán)境IL-10~+Th17細(xì)胞的形成及作用機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

10 高華嵩;細(xì)胞重編程技術(shù)和移植治療視神經(jīng)損傷的實驗研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙華國;生物水凝膠體系治療兔股骨缺損的效果[D];寧波大學(xué);2017年

2 黃雨;體外沖擊波干預(yù)兔股骨頭缺血壞死實驗研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2016年

3 石正松;Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對兔股骨頭壞死修復(fù)的實驗研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2016年

4 李偉;沙療對兔股骨各骨質(zhì)層與力學(xué)性能間的關(guān)聯(lián)性分析[D];新疆大學(xué);2013年

5 胡宏亮;VEGF治療激素誘發(fā)兔股骨頭缺血性壞死的實驗研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

6 廖悅;光敏感自變形水凝膠作為無接觸式3D宏觀/微觀光打印平臺的研究[D];天津大學(xué);2016年

7 劉凌紅;多孔鉭鈮復(fù)合淫羊霍素植入兔股骨實驗與股骨頭壞死中藥治療觀察[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2012年

8 張潔玲;3D打印雙響應(yīng)紫外光固化水凝膠及其形狀記憶功能的研究[D];暨南大學(xué);2017年

9 王梓力;研究ADSCs聯(lián)合BMP-2治療幼年兔股骨頭骺壞死的效果[D];中南大學(xué);2014年

10 李旭光;基于免疫反應(yīng)調(diào)控細(xì)胞在生物材料中的三維遷移行為[D];浙江大學(xué);2017年

，

本文編號：2182102