【摘要】：目的：研究證實,骨髓基質(zhì)細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)在表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)誘導(dǎo)下可向神經(jīng)樣細胞分化,具有促進脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)修復(fù)的作用,但由于EGF、bFGF進入體內(nèi)后迅速擴散、變性或酶解,無法保持其生物活性,難以達到體內(nèi)持續(xù)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞向神經(jīng)樣細胞分化的作用。運用殼聚糖緩釋微球負載細胞因子能夠達到抵御人體代謝的作用。本實驗的目的是制備殼聚糖緩釋微球負載EGF和bFGF,在體外培養(yǎng)條件下應(yīng)用于BMSCs中,觀察：1、EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球?qū)MSCs活性、增殖能力的影響；2、誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)樣細胞的情況,為進一步聯(lián)合BMSCs、 EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球進行體內(nèi)移植治療SCI提供理論依據(jù)。方法：1.骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)及鑒定：采用貼壁篩選法對取自成年S-D大鼠股骨和脛骨的BMSCs進行分離培養(yǎng),并用細胞免疫熒光方法鑒定BMSCs的干細胞標記物CD44、CD90,骨髓造血干細胞標記物CD45。2. EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球的制備及檢測采用乳化交聯(lián)法,制備EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球。采用elisa方法進行EGF和bFGF的檢測,計算載藥率、包裝率及微球的緩釋率。流式細胞術(shù)檢測空白殼聚糖緩釋微球?qū)MSCs的細胞毒性。3. EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的觀察：準備如下分組：a、對照組,BMSCs+DMEM;b、空白殼聚糖緩釋微球組,BMSCs+DMEM+空白殼聚糖緩釋微球；c、EGF/bFGF直接給藥組,BMSCs+DMEM+bFGF(終濃度lOng/ml)+EGF(終濃度20ng/ml);d、EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球組,BMSCs+DMEM+EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球細胞(使之終釋放濃度與C組相同)；光鏡下觀察BMSCs細胞學(xué)形態(tài)的變化,MTT比色法檢測BMSCs的生長增殖情況,進一步利用免疫熒光檢測神經(jīng)前體細胞標記物Nestin、神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE和星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP染色情況。結(jié)果：1、原代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞10-14d時細胞融合成片,細胞形態(tài)多呈長梭形。經(jīng)4-5次傳代,細胞純度較高,主要以呈細長梭形的BMSCs為主。第5代體外培養(yǎng)BMSCs用細胞免疫熒光方法進行鑒定,觀察到細胞呈CD44和CD90陽性表達,CD45呈陰性表達。2、乳化交聯(lián)法進行緩釋微球的制備,經(jīng)ELISA法檢測得知：殼聚糖終濃度為2mg/ml時,平均載藥量最高；而緩釋微球的包裝率隨著TPP濃度的升高逐漸升高,當其濃度為0.45mg/ml時,包封率達到峰值。EGF和bFGF在PH7.4和PH5.8的溶劑中,24h內(nèi)均出現(xiàn)了一個約40-60%的突釋過程,隨后開始緩慢釋放。3、采用流式細胞結(jié)合Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞的凋亡情況,正常對照組和殼聚糖緩釋微球處理組24h后細胞凋亡率無顯著性差異(P0.05)。MTT法檢測BMSCs的生長增殖情況,四組BMSCs細胞存活率的比較結(jié)果：與對照組相比,空白殼聚糖緩釋微球組的細胞增殖率沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),EGF/bFGF組和EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球組其細胞存活率在相同時間點均較對照組和空白殼聚糖緩釋微球組顯著升高(P0.05)。Annexin V-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果表明空白殼聚糖緩釋微球無生物學(xué)毒性。MTT法檢測結(jié)果表明空白殼聚糖緩釋微球作為載體對BMSCs的存活無顯著影響,EGF/bFGF組和EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球組可促進BMSCs的生長增殖。4、四組BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后,空白殼聚糖緩釋微球組和對照組均未發(fā)生變化,仍然維持BMSCs的典型形態(tài)。EGF/bFGF直接給藥組和EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球組部分細胞呈現(xiàn)神經(jīng)細胞樣的改變。高內(nèi)涵免疫熒光檢測：EGF/bFGF組與EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球組：Nestin、NSE、GFAP熒光染色均有陽性表達。共聚焦免疫熒光鑒定：EGF/bFGF組：(36.51±2.53)%的細胞表達神經(jīng)前體細胞標記物Nestin, (17.66±3.44)%的細胞表達神經(jīng)元細胞標志物NSE,(27.39±3.03)%的細胞表達星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP; EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球組：(30.87±3.53)%的細胞表達神經(jīng)前體細胞標記物Nestin,(10.57-2.24)%的細胞表達神經(jīng)元細胞標志物NSE,(21.31±4.69)%的細胞表達星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP,結(jié)論：1、采用貼壁篩選法對大鼠BMSCs進行培養(yǎng)是一種簡單易行的方法,可迅速獲得大量純度較高的BMSCs.2、乳化交聯(lián)法制備EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球,工藝簡單,包封率高,載藥量大,在中性PH值條件下有良好的緩釋性能,對BMSCs無生物學(xué)毒性,可以促進BMSCs的生長增殖。3. EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球能誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞分化為神經(jīng)樣細胞。4.EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)樣細胞的效率較直接EGF/bFGF低,可能與EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球釋放細胞因子的初始濃度低有關(guān)。EGF-bFGF-殼聚糖緩釋微球誘導(dǎo)BMSCs分化的最佳濃度有待進一步檢測。
[Abstract]:Objective : To study the effects of bone marrow stromal cells ( MSCs ) on the differentiation of nerve - like cells under the induction of epidermal growth factor ( EGF ) and basic fibroblast growth factor ( bFGF ) .
Methods : 1 . In vitro culture and identification of bone marrow stromal cells : 1 . In vitro culture and identification of bone marrow stromal cells : 1 . In vitro culture and identification of bone marrow stromal cells : The stem cell marker CD44 , CD90 and bone marrow hematopoietic stem cell marker CD45.2 were identified by cell immunofluorescence method . The preparation and detection of EGF - bFGF - chitosan sustained - release microspheres by emulsion crosslinking method were used to prepare the EGF - bFGF - chitosan sustained - release microspheres . The detection of EGF and bFGF was carried out by the enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) , the drug loading rate , the packing ratio and the slow release rate of microspheres were calculated . The cytotoxicity of the blank chitosan sustained - release microspheres was detected by flow cytometry . The effects of EGF - bFGF - chitosan sustained - release microspheres on neuron - like cell differentiation were observed .
c , EGF / bFGF direct drug administration group , bone marrow + DMEM + bFGF ( final concentration lOng / ml ) + EGF ( final concentration 20ng / ml ) ; d , EGF - bFGF - chitosan sustained - release microsphere group , bone marrow + DMEM + EGF - bFGF - chitosan sustained - release microsphere cells ( the final release concentration is the same as group C ) ;
The growth and proliferation of bone marrow stromal cells ( Nestin , NSE ) and astrocytes ( GFAP ) were detected by MTT colorimetric assay .
There was no significant difference between EGF / bFGF group and EGF - bFGF - chitosan sustained - release microspheres ( P0.05 ) . EGF - bFGF - chitosan sustained - release microspheres can induce differentiation of bone marrow stromal cells into neural - like cells .
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

【參考文獻】

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4 鄢文海;許p芑，

本文編號：2125345