本文選題：石墨烯泡沫 + 間充質(zhì)干細(xì)胞�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景臨床上,炎癥、Ⅲ度燒傷、體表腫瘤切除、急性創(chuàng)傷及慢性皮膚潰瘍等,均可造成全層皮膚缺損。目前受損皮膚傷口的患病率較高,治療是困難的,往往不盡如人意,給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)負(fù)面的影響。皮膚傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及到許多類型的細(xì)胞和過(guò)程,如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖,細(xì)胞遷移,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成及傷口收縮。目前臨床用于修復(fù)全層皮膚缺損的常用的方方法有自體游離皮片移植、皮瓣移植、異體皮/異種皮移植和人工替代物移植等方法。目前皮膚缺損的治療,臨床上還是以自體皮片移植為主,但植皮成活后在色澤、質(zhì)地、瘢痕增生、供區(qū)愈合等方面存在一定弊端,且供體皮膚數(shù)量是受限的。隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展,組織工程化皮膚的應(yīng)用受到廣泛的關(guān)注。目前,應(yīng)用于臨床的組織工程皮膚產(chǎn)品主要有人工表皮、人工真皮以及復(fù)合全層皮膚,但其對(duì)于傷口愈合往往存在一系列的問(wèn)題,如創(chuàng)面收縮,瘢痕形成,與宿主的整合差,早期血管形成差。移植早期缺乏血管結(jié)構(gòu),不能及時(shí)建立血運(yùn)是目前的組織工程化皮膚在臨床應(yīng)用受限、移植成功率不高的一個(gè)重要原因。特別值得關(guān)注的是,瘢痕,除了使受損組織不同程度喪失功能外,還有心理上的相關(guān)的問(wèn)題如審美的創(chuàng)傷和痛苦,顯著影響患者的生活質(zhì)量。近幾年來(lái),采用組織工程的方法,使干細(xì)胞結(jié)合生物材料基質(zhì)促進(jìn)皮膚傷口愈合的研究,已獲得越來(lái)越多的關(guān)注。然而,目前的研究存在著許多障礙,特別是如何采取合適的途徑誘導(dǎo)皮膚再生同時(shí)避免瘢痕,促進(jìn)血管形成。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)已被報(bào)道在改善傷口的愈合方面具有重大的作用,其積極參與傷口的不同階段愈合。BMSCs參與炎癥的衰減調(diào)節(jié)過(guò)程,提高促血管生成因子分泌作用,重塑宿主的免疫,介導(dǎo)傷口愈合的細(xì)胞功能發(fā)揮,有利于組織再生和抑制纖維組織的形成。因而,BMSCs已被認(rèn)為在細(xì)胞治療方面是一個(gè)具有很大潛力的重要的成員,其在促進(jìn)傷口愈合的同時(shí)能減少瘢痕形成,提高創(chuàng)面血管化。生物材料支架是組織工程研究的橋梁,為細(xì)胞的增殖分化、營(yíng)養(yǎng)交換、新陳代謝等生理活動(dòng)提供必需的空間場(chǎng)所,在組織的構(gòu)建過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此,生物材料支架的優(yōu)劣,不僅影響細(xì)胞的生物學(xué)行為和培養(yǎng)效果,而且決定著細(xì)胞移植后能否很好的適應(yīng)、結(jié)合宿主,從而影響到受損皮膚最終的修復(fù)效果。石墨烯泡沫(graphene foam,GF),具有三維多孔結(jié)構(gòu),最近在組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。三維石墨烯泡沫(three-dimensional graphene foam,3D-GFs),具有單層連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)。有報(bào)道研究表明,3D-GFs的孔隙率高達(dá)99.5±0.2%,具有100至300μm的孔徑,可能具有較高的傷口的水分保持能力。因此,該3D-GFs結(jié)構(gòu)是一種很有前途的候選細(xì)胞支架,因?yàn)樗赡芸偤闲螤睢⒒瘜W(xué)和電學(xué)的特性在同一支架中的發(fā)揮作用,為皮膚組織再生提供一個(gè)適宜的環(huán)境,優(yōu)于傳統(tǒng)的惰性生物材料。研究證實(shí)二維石墨烯的獨(dú)特性質(zhì)可誘導(dǎo)干細(xì)胞優(yōu)先分化為特定的譜系,3D-GFs亦可作為具有生物相容性的導(dǎo)電支架,誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的分化增殖,且能誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。引起臨床興趣的是,3D-GFs能在體外促使細(xì)胞增殖與分化,其多孔三維結(jié)構(gòu)可提供三維微環(huán)境,能模擬細(xì)胞體內(nèi)皮膚傷口愈合過(guò)程。此外,在傷口感染治療方面,石墨烯材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌和抗真菌作用。石墨烯泡沫的上述特性,為選擇其作為組織工程細(xì)胞支架提供了新的治療思路。在這項(xiàng)研究中,我們假設(shè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與石墨烯泡沫的生物力學(xué)和生化特征協(xié)同,能改善創(chuàng)傷愈合環(huán)境,促進(jìn)早期血管形成和減少瘢痕。基于以上研究背景,本研究將從大鼠骨髓提取間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)進(jìn)行分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增,以3D-GFs做為細(xì)胞支架,負(fù)載BMSCs,移植到皮膚受損創(chuàng)面,進(jìn)行創(chuàng)面愈合、血管化和瘢痕的研究。研宄目的檢測(cè)3D-GFs支架的生物相容性;觀察3D-GFs和BMSCs在創(chuàng)面愈合中作用;并進(jìn)一步觀察3D-GFs和BMSCs在創(chuàng)面血管化和減輕瘢痕方面的效應(yīng);最終為皮膚傷口治療提供新的思路和途徑,為其在組織工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法1.取成年雄性SD大鼠股骨、脛骨骨髓腔內(nèi)細(xì)胞,采用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行分離培養(yǎng)擴(kuò)增。取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物CD54、CD73、CD45和CD34表達(dá),同時(shí)進(jìn)行成脂、成骨能力檢測(cè),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并進(jìn)一步使用油紅染色、茜素紅染色觀察定向誘導(dǎo)的效果。2.采用化學(xué)氣相沉積法合成3D-GFs,使用掃描電顯微鏡和金相顯微鏡觀察樣品表面形貌,能譜儀和拉曼光譜儀,進(jìn)一步進(jìn)行樣品材料成分分析。3.將大鼠BMSCs分別接種于3D-GFs、聚苯乙烯基板(Tissue Culture Polystyrene,TCPS),使用MTT法、LDH法、BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。并同時(shí)采用免疫熒光法檢測(cè)大鼠BMSCs在3D-GFs上生長(zhǎng)情況。4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):將體重220-300g的雄性SD大鼠隨機(jī)平均分為三組對(duì)照組、GF組和GF加MSCs組。在大鼠背部制造全層皮膚缺損切口,所有傷口均用透明敷料覆蓋,并使用彈性繃帶加以固定。將動(dòng)物關(guān)在單獨(dú)的籠子里,允許自由采食,每天觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的創(chuàng)面變化。術(shù)后第3d、7、10和14d,采用CO2吸入法處死大鼠,實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測(cè) VEGF、bFGF、TGF-β1,TGF-β3,α-SMA 的表達(dá);術(shù)后 14d,行HE染色組織學(xué)染色檢測(cè)再生皮膚厚度;術(shù)后7、14d進(jìn)行各組再生皮膚可溶性膠原含量的測(cè)定。待各組皮膚傷口愈合后,取新愈合皮膚進(jìn)行水化作用、經(jīng)皮水分流失、抗拉力強(qiáng)度和彈性位移測(cè)定。結(jié)果1.采用全骨髓培養(yǎng)法成功分離出BMSCs,第5d發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng),以梭形細(xì)胞為主,生長(zhǎng)旺盛,連續(xù)傳代4代,未見(jiàn)有細(xì)胞明顯衰退。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示表達(dá)CD54、CD73,其陽(yáng)性率分別為98%和97%;而造血干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD45、CD34陽(yáng)性率僅為1%、1.5%。成脂、成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后,油紅染色、茜素紅染色均為陽(yáng)性。2.采用化學(xué)氣相沉積法成功合成了 3D-GFs,掃描電鏡和金相顯微鏡觀察,其具有單層連續(xù)多孔結(jié)構(gòu),孔隙率為99.7±0.3%,孔徑大小100-350μm,骨架寬度40-100μm。拉曼光譜儀測(cè)定結(jié)果確定合成的GF含有單層和少層的石墨烯,能譜儀測(cè)試結(jié)果表明GF的表面碳為主要元素,未能明顯測(cè)出鎳元素。3.MTT法和LDH法檢測(cè)表明,與TCPS相比,3D-GFs對(duì)大鼠BMSCs的增殖無(wú)顯著性差異(P0.05)。BrdU摻入法結(jié)果分析表明,從第5d開(kāi)始,3D-GFs對(duì)大鼠BMSCs增殖活力顯著高于TCPS(P0.01)。同時(shí)免疫熒光共聚焦顯微鏡顯示大鼠BMSCs在3D-GFs具有良好的細(xì)胞粘附,能形成三維網(wǎng)絡(luò)。4.傷口面積和愈合時(shí)間分析顯示,GF組與對(duì)照組的創(chuàng)面愈合比較無(wú)顯著性差異(P0.05)。移植后3d,與其他2組相比,GF加MSCs組傷口面積明顯縮小(P0.01),傷口愈合時(shí)間亦明顯縮短(P0.01)。血管化VEGF和bFGF的mRNA水平檢測(cè)顯示GF組與對(duì)照組相比,沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異(P0.05);從3d到14d,GF加MSCs組表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.01)和GF(P0.01)組。GF加MSCs組TGF-β1水平與其它2組相比明顯降低(P0.01)。TGF-β3的表達(dá)在3組是一個(gè)相反的趨勢(shì),并在GF加MSCs組的表達(dá)水平明顯高于其他2組(P0.01)。αα-SMA mRNA水平隨著時(shí)間的推移,與TGF-β1的表達(dá)水平調(diào)節(jié)趨勢(shì)相似。GF組TGF-β1(從10d),TGF-β3(從第10d),和α-SMA(從7d)與對(duì)照組相比,存在顯著性差異(P0.05)。皮膚厚度、可溶性膠原含量、抗拉力強(qiáng)度和彈性位移測(cè)定,GF加MSCs組表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.01或P0.05)和GF組(P0.01或P0.05),GF組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P0.05)。水化作用、經(jīng)皮水分流失測(cè)定,GF加MSCs組優(yōu)于GF組(P0.01或P0.05)和對(duì)照組(P0.01),GF組優(yōu)于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法可成功分離擴(kuò)增大鼠BMSCs,表達(dá)MSCs表面抗原,具有多項(xiàng)分化潛能。2.采用化學(xué)氣相沉積法能合成的3D-GFs,其具有單層連續(xù)多孔結(jié)構(gòu),且雜質(zhì)少,缺陷少,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。3.3D-GFs對(duì)BMSCs無(wú)細(xì)胞毒作用,相容性高,且能促進(jìn)細(xì)胞增殖。4.3D-GFs負(fù)載BMSCs能上調(diào)VEGF和bFGF,促進(jìn)血管的形成,上調(diào)TGF-β1和α-SMA,下調(diào)TGF-β3,具有抗瘢痕作用。5.3D-GFs負(fù)載BMSCs能明顯促進(jìn)皮膚傷口愈合,提高愈合皮膚質(zhì)量。6.3D-GFs能一定程度上改善愈合皮膚質(zhì)量,減輕創(chuàng)面瘢痕的形狀。
[Abstract]:In recent years , there is a series of problems in the treatment of skin defects , such as epidermal cells , fibroblasts , endothelial cell proliferation , cell migration , extracellular matrix ( ECM ) synthesis and wound contraction . Bone marrow derived mesenchymal stem cells ( BSCs ) have been reported to play an important role in improving wound healing . In this study , bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) were isolated , cultured and expanded . The expression of VEGF , bFGF , TGF - 尾1 , TGF - 尾3 , 偽 - SMA was detected by means of the method of chemical vapor deposition . 3 . 3D - GFs can up - regulate VEGF and bFGF , promote the formation of blood vessels , regulate TGF - 尾1 and 偽 - SMA , regulate TGF - 尾3 , and improve the quality of healing skin .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R622

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本文編號(hào)：2117503