本文選題：hUCSCs + PACs��； 參考：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?理想的種子細(xì)胞是軟骨組織工程中的核心要素,是實(shí)現(xiàn)軟骨組織結(jié)構(gòu)與功能性再生的必要前提,也是當(dāng)前科學(xué)研究的重大熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌?1.結(jié)合臨床需求及前期研究結(jié)果,以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived stem cells, hUCSCs)和原代軟骨細(xì)胞(primary articular chondrocytes, pACs)作為種子細(xì)胞,脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(decellularized articular cartilage extracellular matrix, ACECM )取向支架作為載體,構(gòu)建出 3D 共培養(yǎng)體;2.體外檢測(cè)3D共培養(yǎng)體中種子細(xì)胞的生物學(xué)行為變化及組織學(xué)特性,評(píng)價(jià)共培養(yǎng)體所構(gòu)建的組織工程軟骨的功能特性;3.通過(guò)大動(dòng)物山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)全層軟骨缺損體內(nèi)修復(fù)實(shí)驗(yàn),觀察共培養(yǎng)體體內(nèi)修復(fù)軟骨損傷的潛能,綜合評(píng)價(jià)共培養(yǎng)體在軟骨損傷修復(fù)中的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)方法:1.在無(wú)菌條件下從新鮮的山羊膝關(guān)節(jié)及人臍帶中分離、培養(yǎng)山羊pACs和hUCSCs,并分別進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定,以豬源ACECM取向支架為共培養(yǎng)載體,兩種種子細(xì)胞以不同比例混合(hUCSCs: pACs,分別為100:0、75:25、50:50、25:75、0:100)體外構(gòu)建3D組織工程組織;2.體外共培養(yǎng)1周和3周,通過(guò)基因及蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞學(xué)行為和組織學(xué)特性評(píng)價(jià)并比較各組共培養(yǎng)體組織工程組織的生物學(xué)特性;3.以成年山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象,膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)股骨髁處造全層軟骨缺損為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?選擇體外檢測(cè)混合共培養(yǎng)比例較好的共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組(co-culture group, CC),條件對(duì)照組為單純ACECM取向支架組(ACECM group,AC)、微骨折組(microfracture group, MF)、ACECM 取向支架復(fù)合 hUCSCs(ACECM+hUCSCs group, ACUC)、ACECM 取向支架復(fù)合 pACs 組(ACECM+pACs, ACAC),空白對(duì)照組為單純?nèi)珜雨P(guān)節(jié)軟骨損傷組(Blank Contorl group,BC),每組3只山羊。術(shù)后2周、4周分別抽取關(guān)節(jié)液涂片行HE染色,觀察炎癥反應(yīng)。在術(shù)后6、9個(gè)月后分別用過(guò)量麻醉劑處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,取材參照國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)-軟骨修復(fù)大體評(píng)分系統(tǒng)和軟骨修復(fù)組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)新生的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察及評(píng)分、人組織相容性I類抗原(HLA-ABC)觀察修復(fù)區(qū)細(xì)胞的來(lái)源、軟骨特異性基質(zhì)成分定量檢測(cè)(糖胺多糖)、影像學(xué)檢測(cè)(7.0高分辨率核磁共振)及全膝關(guān)節(jié)影像學(xué)評(píng)分和生物力學(xué)檢測(cè)(納米壓痕技術(shù))綜合系統(tǒng)評(píng)價(jià)并比較各組軟骨修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.分離獲取的pACs及hUCSCs倒置顯微鏡下觀察分別為類圓形和長(zhǎng)梭形,免疫熒光檢測(cè)顯示pACs具有很好的軟骨細(xì)胞特性,流式細(xì)胞技術(shù)與體外誘導(dǎo)成軟骨實(shí)驗(yàn)得出hUCSCs具備干細(xì)胞的表征,并應(yīng)用兩種種子細(xì)胞以ACECM取向支架為載體,成功構(gòu)建不同比例的共培養(yǎng)體;2.體外共培養(yǎng)1、3周后,大體觀可見支架孔隙被細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)不同程度的填充,死活染色可見各組細(xì)胞均生長(zhǎng)良好,其中以100:0組細(xì)胞生長(zhǎng)最快,0:100組細(xì)胞生長(zhǎng)最慢,在細(xì)胞增殖檢測(cè)方面,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后pACs的生長(zhǎng)相對(duì)增快,而hUCSCs則表現(xiàn)為相對(duì)減緩,RT-PCR結(jié)果顯示hUCSCs軟骨相關(guān)基因(如collagenⅡ、aggrecan)表達(dá)水平上調(diào),組織學(xué)染色(HE、番紅“O”及免疫熒光)均可見共培養(yǎng)組分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨組織特異性細(xì)胞外基質(zhì)成分,人組織相容性抗原免疫熒光染色顯示在修復(fù)區(qū)呈現(xiàn)陽(yáng)性,表明hUCSCsS存活并參與軟骨損傷的修復(fù)過(guò)程,糖胺多糖定量檢測(cè)表現(xiàn)為共培養(yǎng)組明顯優(yōu)于兩種細(xì)胞分別單純培養(yǎng)組,western-blot顯示collagenⅡ與aggrecan蛋白表達(dá)總量在共培養(yǎng)組也較高,以50:50及25:75兩組表達(dá)量更高,其中collagen Ⅰ在50:50組相對(duì)較低,均衡各檢測(cè)指標(biāo)以50:50組最具優(yōu)勢(shì)進(jìn)入體內(nèi)修復(fù)實(shí)驗(yàn);3.關(guān)節(jié)液涂片HE染色結(jié)果顯示,術(shù)后各實(shí)驗(yàn)組膝關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)與空白對(duì)照組相比未見明顯差異。大體形態(tài)學(xué)觀察及組織學(xué)染色結(jié)果均證實(shí),實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)再生的關(guān)節(jié)軟骨更加接近天然軟骨,且與周邊整合良好,保持軟骨下骨的完整性,獲得更好的修復(fù)效果,生物力學(xué)檢測(cè)表明實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)組織力學(xué)強(qiáng)度較好,在9月結(jié)果中明顯優(yōu)于其他各組,糖胺多糖定量檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組新生組織含量明顯高于其他各組,影像學(xué)結(jié)果(MRI)及評(píng)分可見實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)軟骨組織及軟骨下骨信號(hào)與周圍正常組織相似,T2W1抑脂像信號(hào)均勻,9月結(jié)果中軟骨下骨水腫信號(hào)基本消失,關(guān)節(jié)腔關(guān)節(jié)液信號(hào)低。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:分離培養(yǎng)出pACs和hUCSCs,以ACECM取向支架為載體在體外成功構(gòu)建共培養(yǎng)體;不同比例的共培養(yǎng)體體外培養(yǎng),獲得了具有較好軟骨組織特性的組織工程組織,hUCSCs被成功的天然誘導(dǎo)分化成軟骨,同時(shí)增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞活性,促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖;大動(dòng)物體內(nèi)軟骨修復(fù)實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)地驗(yàn)證了由hUCSCs和pACs共同構(gòu)建的共培養(yǎng)體可成功修復(fù)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損,且新生組織特性更加接近天然軟骨組織,同時(shí)保持了軟骨下骨的完整性。結(jié)論,通過(guò)pACs和hUCSCs混合在ACECM取向支架中共培養(yǎng),獲得了具有較好軟骨組織特性的組織工程軟骨組織,實(shí)現(xiàn)了大動(dòng)物體內(nèi)損傷軟骨的成功修復(fù),一定程度上克服了干細(xì)胞機(jī)械性誘導(dǎo)分化帶來(lái)的分化不足或軟骨鈣化等問(wèn)題,以及軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增面臨的去分化困境,因此hUCSCs和pACs共培養(yǎng)即克服了基礎(chǔ)問(wèn)題又符合臨床需求,有望成為未來(lái)軟骨組織修復(fù)與再生最具前景的策略之一。
[Abstract]:Objective : To study the biological behavior and histological characteristics of articular cartilage in vitro and to evaluate the potential of co - culture in the repair of cartilage damage . The results were as follows : 1 . After 6 and 9 months after operation , we observed the expression level up - regulation of human articular cartilage . Conclusion : The tissue engineering cartilage tissue with better cartilage tissue characteristics is obtained by mixing pACLS and hUCSCs in ACECM oriented scaffolds . The successful repair of cartilage in large animals has been achieved . Therefore , the co - culture of hUCSCs and pACDs can overcome the underlying problems and meet the clinical needs , which is expected to be one of the most promising strategies for future cartilage tissue repair and regeneration .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R681.3

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本文編號(hào)：2092949