本文選題：尿源干細(xì)胞 + 脂肪干細(xì)胞　； 參考：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:本實驗從成人清潔中段尿中分離尿源干細(xì)胞(human urine-derived stem cells,USCs),并探究USCs的生物學(xué)特征,通過增殖速度、表面標(biāo)志物和多向分化潛能比較USCs與脂肪來源的干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的生物學(xué)特征;在此基礎(chǔ)上,探究骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2)轉(zhuǎn)染對USCs成骨分化能力的影響;然后,研究USCs在磷酸三鈣(β-TCP)上的生物學(xué)行為,最后,將USCs接種至β-TCP上并移植到大鼠股骨大段骨缺損中,探究USCs/β-TCP復(fù)合物對大段骨缺損的修復(fù)作用。方法:第一部分:收集健康成人清潔中段尿200 ml,離心洗滌后加入配制的專用培養(yǎng)基來培養(yǎng)USCs。通過CCK-8和流式細(xì)胞儀檢測USCs增殖能力和表面標(biāo)志物。加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,探究USCs成骨、成軟骨和成脂肪分化能力。第二部分:體外構(gòu)建含人BMP2基因的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染USCs,檢測轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力,檢測轉(zhuǎn)染對USCs堿性磷酸酶活性(ALP),礦鹽沉積和成骨標(biāo)志物表達(dá)的影響,將轉(zhuǎn)染BMP2的USCs移植到裸鼠體內(nèi)分析其異位成骨能力。第三部分:分離并擴增USCs,將USCs接種至β-TCP支架上,通過掃描電鏡,CCK-8和活死細(xì)胞染色檢測USCs在β-TCP上的粘附、增殖和存活,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7天和14天后,通過ALP活性和成骨基因表達(dá)檢測USCs在β-TCP上成骨分化情況。第四部分:將USCs/β-TCP復(fù)合物移植到大鼠6 mm股骨缺損處,在術(shù)后4、8和12周通過X線,micro-CT以及組織學(xué)染色來分析骨缺損的愈合情況。結(jié)果:第一部分:5-7 d后在培養(yǎng)板中觀察到細(xì)胞克隆出現(xiàn),14 d后可以達(dá)到90%的融合。CCK-8證實貼壁細(xì)胞增殖活躍,與ASCs一樣呈現(xiàn)“S”形增殖曲線。流式細(xì)胞儀結(jié)果證實USCs和ASCs表達(dá)CD29,CD44,CD73,CD90,不表達(dá)CD31,CD34,CD45,CD133和HLA-DR。但CD105在ASCs中表達(dá)較高,而在USCs中表達(dá)較低。USCs可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。與ASCs具有同樣的多向分化能力。經(jīng)過體外多次傳代后,USCs仍然顯示正常的核型。第二部分:流式結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%,且轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖未受明顯的影響。慢病毒轉(zhuǎn)染BMP2基因到USCs后,BMP2基因表達(dá)和蛋白分泌量明顯增多,BMP2轉(zhuǎn)染組ALP活性和礦鹽沉積明顯高于普通USCs和GFP轉(zhuǎn)染組。同時BMP2-USCs高表達(dá)成骨相關(guān)的標(biāo)志物:Runx2和OCN,組織學(xué)染色分析顯示BMP2-USCs移植組在裸鼠肌袋中形成大量的新生骨。第三部分:USCs可以在β-TCP支架上粘附、增殖和存活。ALP活性和成骨相關(guān)基因表達(dá)證實USCs向成骨細(xì)胞分化。第四部分:X線和micro-CT結(jié)果證實USCs/β-TCP組修復(fù)效果明顯優(yōu)于單純β-TCP和空白對照組。組織學(xué)染色同樣證明USCs/β-TCP組新生骨明顯多于單純β-TCP和空白對照組。熒光顯微鏡顯示USCs/β-TCP組礦鹽沉積速度明顯快于β-TCP和空白對照組。術(shù)后12周抗人細(xì)胞核抗體證實USCs在骨缺損部位的存活。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示USCs/β-TCP能明顯的促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。結(jié)論:從成人清潔中段尿液中可以分離得到USCs,USCs具有與ASCs類似的生物學(xué)特征。BMP2基因轉(zhuǎn)染有效的促進(jìn)USCs成骨分化。USCs能在β-TCP上粘附,增殖,存活和成骨分化。USCs/β-TCP移植能顯著促進(jìn)骨缺損的修復(fù),USCs可做為骨組織工程的種子細(xì)胞。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of USCs on the bone formation and differentiation of USCs by means of CCK - 8 and flow cytometry . The results showed that USCs were cultured on 尾 - TCP and cultured for 7 days and 14 days . The results showed that the proliferation and survival of USCs were investigated by means of CCK - 8 and flow cytometry . The results showed that USCs / 尾 - TCP groups were significantly higher than that of 尾 - TCP and blank control group . The results showed that USCs / 尾 - TCP group had better effect on bone defects .
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R687

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王臻;郭征;李靖;盧建熙;陳國景;;多孔磷酸三鈣人工骨修復(fù)腔隙性骨缺損的隨機對照研究[J];中華骨科雜志;2011年06期

2 熊建文;肖化;張鎮(zhèn)西;;MTT法和CCK-8法檢測細(xì)胞活性之測試條件比較[J];激光生物學(xué)報;2007年05期

，

本文編號：1912344