本文選題：軟骨分化 + Sox9��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2)隸屬于BMPs家族,可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells)成軟骨分化。因此被認(rèn)為是構(gòu)建基因強(qiáng)化的組織工程軟骨的重要因子。聯(lián)合運(yùn)用Sox9可在增強(qiáng)BMP2誘導(dǎo)軟骨化的同時(shí)抑制BMP2所介導(dǎo)的成骨分化,從而優(yōu)化了成軟骨效應(yīng),但其作用靶點(diǎn)仍不明確。而B(niǎo)MP2誘導(dǎo)下上調(diào)的Smad7作為成軟骨負(fù)性因子被發(fā)現(xiàn)在軟骨內(nèi)成骨中起到重要作用,可能是Sox9作用的潛在靶點(diǎn)。本研究主要探討Sox9與Smad7在BMP2誘導(dǎo)的軟骨分化與軟骨終末成熟骨化的關(guān)系,為組織工程軟骨的構(gòu)建與穩(wěn)定提供新思路新靶點(diǎn)。方法：(1)用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增已經(jīng)構(gòu)建完成的腺病毒Ad-BMP2、 Ad-Smad7和Ad-Sox9后轉(zhuǎn)染入小鼠骨髓MSCs C3H10T1/2,到達(dá)目標(biāo)時(shí)間后Western-blot檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)情況；(2)平面培養(yǎng)情況下按照測(cè)定滴度將AdBMP2, AdBMP2+AdSox9轉(zhuǎn)染C3H10T1/2, AdGFP轉(zhuǎn)染組作對(duì)照,以微球培養(yǎng)的方式模擬三維狀態(tài)一直到14天,提取RNA逆轉(zhuǎn)錄后,QPCR檢測(cè)各處理組不同時(shí)間點(diǎn)Smad7、OPN與MMP13；提取各種總的蛋白測(cè)定濃度后采用Western-blot技術(shù)檢測(cè)各情況之下Smad7的蛋白水平；(3)平面培養(yǎng)的C3H10T1/2細(xì)胞用AdBMP2和／或AdSox9感染,以AdGFP感染組作對(duì)照,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)各處理組細(xì)胞基質(zhì)Smad7表達(dá)情況；(4)通過(guò)裸鼠皮下注射高濃度的感染目的病毒的C3H10T1/2的方式構(gòu)建成軟骨成骨在體模型。將獲得的骨塊進(jìn)行形態(tài)與組織觀察,以了解Smad7在不同的水平下對(duì)BMP2介導(dǎo)的軟骨化與軟骨內(nèi)成骨的作用。(5)感染離體的胎鼠肢芽,感染目標(biāo)病毒,了解Smad7在不同水平下對(duì)軟骨分化形成與軟骨成熟骨化中的作用(6)通過(guò)對(duì)不同水平Smad7的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),證實(shí)不同水平Smad7對(duì)BMP2誘導(dǎo)凋亡的影響。結(jié)果：(1)各重組腺病毒均可以有效轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞,并穩(wěn)定表達(dá)相關(guān)蛋白。(2)在體外的微球培養(yǎng)中,BMP2可上調(diào)Smad7表達(dá)水平,而外源性高表達(dá)Sox9能抑制BMP2誘導(dǎo)的Smad7水平上調(diào),Smad7相關(guān)因子OPN與MMP13基因表達(dá)水平也可被Sox9抑制。(3)在免疫組化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的Sox9可抑制由BMP2所上調(diào)的Smad7表達(dá),使其維持低表達(dá)狀態(tài)。(4)裸鼠皮下種植成骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)高表達(dá)Sox9組在抑制Smad7表達(dá)情況下促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)的軟骨形成,抑制BMP2介導(dǎo)的軟骨內(nèi)化骨,而高表達(dá)Smad7組軟骨與成骨均形成受抑。(5)胎鼠前肢器官培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Sox9抑制BMP2誘導(dǎo)的Smad7可促進(jìn)肢芽軟骨細(xì)胞的增殖分化而抑制肢芽軟骨細(xì)胞肥大,而高表達(dá)Smad7抑制增殖區(qū)域加大肥大區(qū)域。(6)高表達(dá)Sox9組可降低BMP2誘導(dǎo)的凋亡,而高表達(dá)Smad7會(huì)提高BMP2誘導(dǎo)的凋亡。結(jié)論：Sox9可抑制BMP2誘導(dǎo)下的Smad7及其相關(guān)因子,從而解放軟骨化阻礙軟骨內(nèi)成骨進(jìn)程。通過(guò)調(diào)節(jié)Smad7表達(dá)水平可能達(dá)到增強(qiáng)軟骨化抑制軟骨終末成熟凋亡骨化的作用。為Sox9與BMP2的聯(lián)合運(yùn)用提供理論支持,為生物工程軟骨的構(gòu)建與穩(wěn)定提供了新靶點(diǎn)。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein - 2 ( BMP - 2 ) belongs to BMPs family and can induce mesenchymal stem cells to differentiate into cartilage .
( 2 ) AdBMP2 , AdBMP2 + AdSox9 were transfected into C3H10T1 / 2 and AdGFP transfection group under the condition of planar culture . The three - dimensional state was simulated in three - dimensional state until 14 days in the manner of microball culture . After RNA reverse transcription was extracted , the different time points of the various treatment groups were detected by QPCR , and the expression of Smad3 , osteal and MMP 13 were detected by QPCR .
Western - blot was used to detect the protein level of Smad3 in each case after extraction of various total protein concentrations .
( 3 ) AdBMP2 and / or AdSox9 were infected with AdBMP2 and / or AdSox9 in the C3H10T1 / 2 cells cultured in plane , and the expression of Smad3 expression was detected by immunohistochemistry in each treatment group .
( 4 ) In vitro microball culture , BMP2 could increase the expression level of BMP2 and inhibit BMP2 - induced apoptosis .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R68

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本文編號(hào)：1901115