本文選題：微小RNA-101 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景:隨著人口社會(huì)老齡化的加劇,機(jī)械交通運(yùn)輸行業(yè)的飛速發(fā)展,骨折延遲愈合、骨折不愈合(骨不連)、脊柱融合失敗及骨質(zhì)疏松癥等骨形成障礙性疾病及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率越來越高,嚴(yán)重影響了人們的生活、學(xué)習(xí)和工作,成為臨床骨科醫(yī)師的重大難題之一。骨的形成發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)的生理調(diào)節(jié)過程,由多種功能細(xì)胞參與,詳細(xì)了解骨生成的分子信號(hào)機(jī)制并進(jìn)行干預(yù)調(diào)控,不僅能夠延緩減輕骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,促進(jìn)骨折愈合,還能夠縮短脊柱融合時(shí)間,提高脊柱融合率。成骨細(xì)胞來源于間質(zhì)細(xì)胞,分泌功能強(qiáng)大,通過骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化,參與骨的形成,是骨生成的主要功能細(xì)胞。成骨細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來,其分化時(shí)機(jī)及分化方向受嚴(yán)格的分子調(diào)控,該調(diào)控機(jī)制是由極其復(fù)雜的信號(hào)通路分子及其構(gòu)成的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。系統(tǒng)、完整地認(rèn)識(shí)研究間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制,是進(jìn)一步研究成骨細(xì)胞分化的條件,同時(shí)也是實(shí)現(xiàn)骨組織工程化應(yīng)用研究的重要基礎(chǔ)。成骨細(xì)胞是由具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下分化而來,經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化中發(fā)揮重要作用,在調(diào)控骨的生成發(fā)育方面扮演主要角色。Wnt信號(hào)蛋白作為一類分泌型糖蛋白,主要通過旁分泌/自分泌、內(nèi)分泌發(fā)揮作用。Wnt信號(hào)通路活化后抑制胞質(zhì)中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)降解,β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累增加。β-catenin屬于蛋白質(zhì),具有多種功能,如:粘附、基因表達(dá)調(diào)控等等,在細(xì)胞連接處β-catenin與鈣粘素相互作用,參與細(xì)胞間粘合帶的形成;游離的β-catenin則進(jìn)入細(xì)胞核,參與基因的表達(dá)調(diào)控。研究顯示wnt信號(hào)通路分泌的糖蛋白對(duì)骨骼多種組織的發(fā)育起決定性作用。微小RNA(miRNA)種類數(shù)量繁多,通常由22(約23-25)個(gè)核苷酸構(gòu)成,屬于內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子,與靶基因m RNA 3’非翻譯區(qū)相結(jié)合,一方面與胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA沉默核糖核蛋白復(fù)合物(RISC),通過序列完全互補(bǔ)的方式特異結(jié)合目標(biāo)m RNA,并將其降解發(fā)揮作用;另一方面通過非完全互補(bǔ)結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)翻譯,從而在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的表達(dá)調(diào)控。目前,在生物體內(nèi)已克隆到近千種miRNA序列,參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等眾多生理病理過程,據(jù)推測(cè)1/3的人類基因可能受到miRNA的表達(dá)調(diào)控。越來越多的證據(jù)表明miRNAs在翻譯后修飾水平參與基因的表達(dá)調(diào)控,在MSCs向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮不可替代的作用,是目前的研究熱點(diǎn)之一。例如:miR-96、miR-124、miR-199a、miR-100、miR-138、miR-204和miR-20a參與成骨細(xì)胞分化的相關(guān)研究均有報(bào)道。miR-101在人類腫瘤細(xì)胞中處于靜止?fàn)顟B(tài),大量研究表明miR-101在人體多種細(xì)胞的代謝過程中發(fā)揮根本性作用,尤其是調(diào)控細(xì)胞增殖與分化。miR-101可能參與MSCs向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控過程,但其具體的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。最近有證據(jù)表明EZH2蛋白抑制Wnt基因表達(dá),導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活,阻斷MSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化。目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過體外原代培養(yǎng)獲得,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)miR-101在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化中的表達(dá)水平變化。利用miR-101抑制劑和模擬物,觀察改變miR-101表達(dá)水平(高表達(dá)/低表達(dá))對(duì)MSCs成骨分化的影響,及其對(duì)靶基因EZH2水平的影響。通過觀察EZH2表達(dá)水平改變對(duì)miR-101介導(dǎo)的h BMSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響及其對(duì)Wnt/β Catenin信號(hào)通路活性的影響,進(jìn)一步揭示miR-101、EZH2及Wnt/β Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的相互關(guān)系,為闡明miR-101在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控機(jī)制中的作用提供新的思路及有力的支持證據(jù)。方法:1.檢測(cè)miR-101在h BMSCs成骨分化中的表達(dá)及其作用。從Cyagen生物科技公司購得成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng),運(yùn)用q RT-PCR技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)觀察miR-101在h BMSCs成骨分化中表達(dá)水平的改變;利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)干預(yù)改變骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的miR-101表達(dá)水平,觀察成骨細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的表達(dá)水平、ALP活性及細(xì)胞礦化水平等,驗(yàn)證miR-101在h BMSCs成骨誘導(dǎo)分化中的作用。2.miR-101對(duì)EZH2的調(diào)節(jié)作用。在前期的實(shí)驗(yàn)中,我們通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)miR-101與EZH2基因的3’UTR區(qū)存在堿基互補(bǔ)關(guān)系;Western blot分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)水平miR-101能夠顯著降低EZH2的蛋白水平,提示EZH2可能是miR-101的直接靶基因,miR-101能夠抑制EZH2基因的表達(dá)。3.EZH2基因調(diào)控miR-101介導(dǎo)的成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。我們通過構(gòu)建質(zhì)粒,干擾EZH2在成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)水平,通過q RT-PCR分析技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)記物的(如RUNX2、ALP、OPN和OCN)表達(dá)及ALP活性的改變。4.Wnt信號(hào)通路在miR-101介導(dǎo)的成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用。通過TOPflash/FOPflash技術(shù)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路的活性,進(jìn)一步通過干預(yù)miR-101和EZH2的表達(dá)水平,觀察Wnt信號(hào)通路的活性改變。結(jié)果:1.miR-101在h BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化中表達(dá)水平明顯升高;2.miR-101促進(jìn)h BMSCs向成骨細(xì)胞分化;3.EZH2作為miR-101的直接靶基因之一,miR-101能夠抑制EZH2的表達(dá);4.EZH2參與miR-101介導(dǎo)的h BMSCs成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化調(diào)控;5.miR-101通過靶基因EZH2,影響Wnt/β Catenin信號(hào)通路的活性,調(diào)控h BMSCs向成骨細(xì)胞分化。結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明EZH2作為miR-101的直接靶基因,miR-101與EZH23’UTR直接結(jié)合,激活下游的Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)h BMSCs向成骨細(xì)胞的定向分化,進(jìn)一步為miR-101調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化提供了新的思路,為骨再生障礙性疾病的治療提供的新的治療靶點(diǎn)和方向。
[Abstract]:BACKGROUND : With the increase of population ' s aging , the rapid development of mechanical transport industry , delayed union of fracture , non - union of fracture ( bone fracture ) , failure of spinal fusion and the formation of bone formation are the major problems of bone formation . 鍒，

本文編號(hào)：1892998