本文選題：骨肉瘤　切入點：DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位　出處：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：第一部分 DNA-PKcs在骨肉瘤細胞和組織中的表達及其臨床意義研究背景骨肉瘤是起源于惡性間充質細胞,以產生骨或骨樣組織為特點的惡性腫瘤,是兒童和青少年中最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤,發(fā)病率為4～5/100萬。雖然接受手術結合化學治療的骨肉瘤患者5年生存率可以達到50%-70%,然而近30年來,骨肉瘤患者的5年生存率無明顯提高,而且已發(fā)生轉移的患者5年生存率僅為20%-30%。因此,探索骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的機制,對改善治療效果、提高患者生存率具有重要意義,具有一定的研究價值。DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位(DNA-PKcs)是磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶(PIKK)家族成員之一,它與異源二聚體復合物Ku70和Ku80共同組成DNA依賴性蛋白激酶復合體(DNA-PK),主要通過非同源末端連接(NHEJ)的方式進行DNA雙鏈斷裂的修復,在維持基因組穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。除此之外,研究發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs在人類細胞的功能活動中還發(fā)揮著諸多其他的生物學功能,如維持染色體端粒穩(wěn)定、調節(jié)能量代謝、促進有絲分裂等。在多種惡性腫瘤中,DNA-PKcs的基因、蛋白表達水平或酶活性明顯偏高,且與患者預后相關。但是,目前有關DNA-PKcs在骨肉瘤中的表達情況及其臨床意義的研究較少,因此我們擬以骨肉瘤細胞和骨肉瘤組織為研究對象,探索DNA-PKcs在骨肉瘤中的表達及其臨床意義。研究目的研究DNA-PKcs在骨肉瘤細胞和組織中的表達情況,及其表達與骨肉瘤臨床特征的相關性,為后續(xù)研究DNA-PKcs在骨肉瘤中的生物學功能及其機制提供理論基礎。研究方法1.采用實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)和蛋白質免疫印跡(Western Blot)方法分別檢測人成骨細胞(hFOB 1.19)和人骨肉瘤細胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)中DNA-PKcs的mRNA和蛋白表達情況。2.采用細胞免疫熒光技術分別檢測hFOB1.19細胞和MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2四種人骨肉瘤細胞中DNA-PKcs蛋白的表達位置和表達量。3.采用免疫組織化學方法分別檢測骨軟骨瘤、骨肉瘤組織中DNA-PKcs蛋白表達情況,并分析骨肉瘤組織中DNA-PKcs蛋白表達與對應標本臨床特征(性別、年齡、腫瘤部位、Enneking分期)的相關性。研究結果1.qRT-PCR和Western Blot結果顯示,DNA-PKcs在四種人骨肉瘤細胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)中均有表達,而且其mRNA和蛋白在人骨肉瘤細胞中的表達水平均明顯高于在人成骨細胞(hFOB 1.19)中的表達水平(P0.05)。2.細胞免疫熒光結果顯示,DNA-PKcs蛋白主要在人骨肉瘤細胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)的核內表達,且比在 hFOB 1.19 細胞中的表達水平高。3.骨肉瘤組織中DNA-PKcs蛋白的陽性表達率顯著高于骨軟骨瘤組織(70.83%vs 5.00%,P0.05),且 DNA-PKcs 蛋白在骨肉瘤中的表達與 Enneking分期具有相關性,EnnekingⅢ期標本中DNA-PKcs蛋白陽性表達率顯著高于EnnekingⅡ期標本(P0.05),而與患者年齡、性別、腫瘤部位無關(P0.05)。結論1.骨肉瘤細胞中DNA-PKcs的基因和蛋白水平高于人成骨細胞,DNA-PKcs蛋白主要在骨肉瘤細胞核內表達。2.骨肉瘤組織中DNA-PKcs蛋白的陽性表達率顯著高于骨軟骨瘤,且DNA-PKcs蛋白的表達與骨肉瘤的Enneking分期相關。第二部分 DNA-PKcs在CD133陽性MG-63細胞順鉑耐藥性中的作用及其分子機制研究背景自輔助化療應用到骨肉瘤治療以來,骨肉瘤患者5年生存率已提高到50%-70%,然而近30年來,骨肉瘤的治療效果已進入平臺期。其中,化療耐藥是阻礙骨肉瘤治療效果進一步提高的重要原因,因此有必要對骨肉瘤化療耐藥發(fā)生的機制展開進一步的研究。在有關惡性腫瘤耐藥的研究中,腫瘤干細胞理論受到人們越來越多的關注,該理論認為腫瘤干細胞除具有干細胞的一般生物學特性外,還具有更強的化學藥物耐受性,在惡性腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用�，F(xiàn)研究表明,骨肉瘤中CD133陽性細胞具有自我更新、多向分化、成瘤等腫瘤干細胞的生物學特性,且對化療藥物具有更強的耐受性。但是,目前對CD133陽性骨肉瘤細胞的耐藥機制仍缺乏更為深入的研究。DNA-PKcs的DNA損傷修復功能已被大量研究證明,它與異源二聚體復合物Ku70和Ku80共同參與,通過非同源末端連接的方式參與DNA雙鏈斷裂的修復。研究發(fā)現(xiàn),DNA-PKcs可通過DNA損傷修復促進腫瘤細胞對化療藥物的抵抗,且DNA-PKcs在骨肉瘤腫瘤干細胞中高表達,因此DNA-PKcs是否可以通過DNA損傷修復導致骨肉瘤腫瘤干細胞耐藥,值得研究。P-糖蛋白(P-gp)是ATP結合盒(ABC)膜轉運蛋白家族中的重要成員,可通過藥物泵出功能降低細胞內藥物濃度,增強腫瘤細胞對化療藥物的耐受性,而且它在骨肉瘤腫瘤干細胞中的表達明顯高于在非腫瘤干細胞中的表達。盡管DNA-PKcs和P-gp在腫瘤耐藥中都發(fā)揮著重要作用,且均在骨肉瘤腫瘤干細胞中高表達,但是有關DNA-PKcs是否可以通過調節(jié)P-gp的表達在骨肉瘤腫瘤干細胞耐藥中發(fā)揮作用的研究還未見報道。另外,PI3K/Akt信號通路中活化的Akt可作用于核因子κB抑制蛋白激酶(IKK),進而降解核因子κB抑制蛋白(IκB),使核因子κB(NF-κB)進入細胞核內發(fā)揮功能。研究表明,NF-κB能夠激活P-gp編碼基因的啟動子,促進基因的轉錄。因此我們推測,DNA-PKcs作為PI3K相關激酶(PIKK)家族中的一員,或許可以通過Akt/NF-K信號通路調節(jié)P-gp的表達,從而增強骨肉瘤腫瘤干細胞的耐藥性。在該部分研究中,我們擬以CD133陽性MG-63細胞為研究對象,探索DNA-PKcs在骨肉瘤腫瘤干細胞順鉑耐藥性中的作用及其分子機制。研究目的1.研究DNA-PKcs在CD133陽性骨肉瘤細胞順鉑耐藥中的作用。2.研究DNA-PKcs是否可以通過DNA損傷修復或調節(jié)P-gp的表達而影響CD133陽性骨肉瘤細胞順鉑耐藥性。研究方法1.采用免疫磁珠分選的方法獲取CD133陽性和陰性MG-63細胞,對比檢測其對順鉑的耐受能力、DNA-PKcs的基因和蛋白表達情況;小干擾RNA(siRNA)下調CD133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs的表達后,檢測細胞順鉑耐藥性的變化,以說明DNA-PKcs在CD133陽性MG-63細胞順鉑耐藥中的作用。2.順鉑作用后,對比檢測CD133陽性和陰性MG-63細胞DNA損傷情況;siRNA下調CD133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs的表達后,檢測順鉑作用后DNA損傷的變化情況,以說明DNA-PKcs在CD133陽性MG-63細胞DNA損傷修復中的作用。3.分別檢測CD133陽性和陰性MG-63細胞中P-gp的基因和蛋白表達情況;采用P-gp抑制劑作用于CD133陽性MG-63細胞后,檢測細胞順鉑耐藥性的變化,以說明P-gp在CD 133陽性MG-63細胞順鉑耐藥中的作用。4.下調CD133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs的表達后,檢測P-gp基因和蛋白水平的變化,以說明CD 133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs對P-gp表達的影響。5.對比檢測Akt/NF-KB信號通路在CD133陽性和陰性MG-63細胞中的活性;采用抑制Akt活性或下調NF-κB表達的方法抑制Akt/NF-KB信號通路的活性后,檢測P-gp基因和蛋白水平的變化,以說明CD133陽性MG-63細胞中Akt/NF-KB信號通路對P-gp表達的影響。6.下調CD133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs的表達后,檢測Akt/NF-KB信號通路活性的變化,以說明CD133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs對Akt/NF-KB信號通路活性的影響。研究結果1.與CD133陰性MG-63細胞相比,CD133陽性MG-63細胞對順鉑具有更強的耐藥性且DNA-PKcs mRNA和蛋白均高表達。然而,下調CD133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs的表達后,細胞對順鉑的耐受性降低。該結果說明,DNA-PKcs在CD133陽性MG-63細胞順鉑耐藥中發(fā)揮著促進作用。2.與CD133陰性MG-63細胞相比,CD133陽性MG-63細胞在接受順鉑作用后產生的DNA雙鏈斷裂較少。但是,下調DNA-PKcs的表達后,CD133陽性MG-63細胞DNA損傷修復能力降低,接受順鉑作用后DNA雙鏈斷裂增加。以上結果說明,DNA-PKcs可通過DNA損傷修復增強CD133陽性MG-63細胞的順鉑耐藥性。3.與CD133陰性MG-63細胞相比,CD133陽性MG-63細胞中P-gp mRNA和蛋白均高表達;抑制P-gp作用后,CD133陽性MG-63細胞的順鉑耐藥性顯著降低。該結果說明,P-gp具有增強CD133陽性MG-63細胞順鉑耐藥性的作用。4.下調CD133陽性MG-63細胞中DNA-PKcs的表達后,P-gp mRNA和蛋白表達水平均降低,即DNA-PKcs參與P-gp的表達。5.與CD133陰性MG-63細胞相比,Akt/NF-κB信號通路在CD133陽性MG-63細胞中處于活化狀態(tài);抑制Akt/NF-κB信號通路可以降低CD133陽性MG-63細胞中P-gp的基因和蛋白水平;下調DNA-PKcs可以降低CD133陽性MG-63細胞中Akt/NF-KB信號通路活性。以上結果說明,DNA-PKcs可以通過Akt/NF-KB信號通路調節(jié)P-gp的表達,從而增強CD133陽性MG-63細胞順鉑耐藥性。結論1.DNA-PKcs在CD133陽性MG-63細胞中高表達且具有增強細胞順鉑耐藥性的作用。2.DNA-PKcs可以通過DNA損傷修復和經Akt/NF-κB信號通路調節(jié)P-gp的表達,發(fā)揮增強CD133陽性MG-63細胞順鉑耐藥性的作用。第三部分 DNA-PKcs在骨肉瘤轉移中的作用及其分子機制研究背景骨肉瘤具有較高的轉移發(fā)生率,最常見的轉移部位為肺臟,遠處轉移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。發(fā)生轉移的骨肉瘤患者預后較差,據(jù)統(tǒng)計,已發(fā)生遠處轉移的患者5年生存率僅為20%-30%。因此,有必要對骨肉瘤轉移的發(fā)生和發(fā)展機制進行研究,以減少遠處轉移的發(fā)生、提高患者生存率。DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位(DNA-PKcs)作為磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶(PIKK)家族成員之一,可以通過調節(jié)下游靶基因的轉錄,參與細胞的生存、炎性反應、代謝調節(jié)、細胞凋亡和細胞周期等多種功能活動。研究表明DNA-PKcs在多種惡性腫瘤中高表達且與預后相關,而且在論文第一部分中我們也發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs在骨肉瘤中高表達且與Enneking外科分期相關。但是,目前能夠明確證明DNA-PKcs在腫瘤轉移中的作用研究甚少,且尚無有關DNA-PKcs與骨肉瘤轉移之間關系的報道。在該部分中,我們將探索DNA-PKcs在骨肉瘤轉移中的作用。另外,基質金屬蛋白酶2(MMP2)和磷酸化的肌球蛋白輕鏈2(p-MLC2)分別可以通過降解細胞外基質和增強肌動蛋白-肌球蛋白收縮,直接影響細胞的運動能力,而且研究發(fā)現(xiàn)MMP2和p-MLC2的表達均與Rho/ROCK信號通路有一定關系。因此,我們推測DNA-PKcs或許可以通過Rho/ROCK信號通路調節(jié)MMP2和p-MLC2的表達,從而在骨肉瘤轉移中發(fā)揮作用。在該部分研究中,我們擬以骨肉瘤細胞為研究對象,通過體外和體內實驗探索DNA-PKcs在骨肉瘤轉移中的作用及其分子機制,從而為針對DNA-PKcs的靶向治療在骨肉瘤轉移治療中的應用提供一定的理論基礎。研究目的1.研究DNA-PKcs對骨肉瘤細胞體外遷移和侵襲能力、體內轉移瘤形成和發(fā)展的影響。2.研究DNA-PKcs是否可以通過Rho/ROCK信號通路調節(jié)MMP2和p-MLC2的表達,從而在骨肉瘤轉移中發(fā)揮作用。研究方法1.采用DNA-PKcs特異性抑制劑NU7026作用于骨肉瘤細胞(MNNG/HOS細胞、MG-63細胞、Saos-2細胞、U2-OS細胞,下同)后,采用細胞劃痕實驗、Transwell細胞遷移實驗檢測骨肉瘤細胞遷移能力的變化,采用Transwell細胞侵襲實驗檢測骨肉瘤細胞侵襲能力的變化,以說明DNA-PKcs在骨肉瘤細胞體外遷移和侵襲中的作用。2.采用DNA-PKcs siRNA慢病毒載體感染骨肉瘤細胞后,熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率,并采用實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)和蛋白質免疫印跡(Western Blot)實驗分別檢測DNA-PKcs mRNA和蛋白水平的變化情況,以評價siRNA的沉默效果。3.采用DNA-PKcs siRNA慢病毒載體感染骨肉瘤細胞,下調DNA-PKcs表達后,Western Blot檢測細胞中MMP2和p-MLC2蛋白水平的變化,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞上清中MMP2分泌的變化,以說明DNA-PKcs對MMP2和P-MLC2表達的調節(jié)作用。4.下調DNA-PKcs表達后,檢測骨肉瘤細胞中具有生物活性的RhoA-GTP酶表達水平的變化,采用qRT-PCR和Western Blot分別檢測骨肉瘤細胞中ROCK 1、ROCK2的基因和蛋白表達水平的變化,以說明DNA-PKcs對RhoA/ROCK信號通路的調節(jié)作用。5.采用ROCK2特異性抑制劑SLx-2119作用于骨肉瘤細胞后,同樣采用細胞劃痕實驗、Transwell細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力的變化,采用Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力的變化,以說明RhoA/ROCK2信號通路在骨肉瘤細胞體外遷移和侵襲中的作用。6.在骨肉瘤細胞中,采用脂質體轉染siRNA下調ROCK2表達后,Western Blot檢測細胞內MMP2和p-MLC2蛋白水平的變化,ELISA檢測細胞上清中MMP2分泌的變化,以說明RhoA/ROCK2信號通路對MMP2和p-MLC2表達的調節(jié)作用。7.將陰性對照siRNA和DNA-PKcs siRNA慢病毒載體分別穩(wěn)定感染MNNG/HOS細胞后,經尾靜脈注入NOD/SCID小鼠體內,建立骨肉瘤轉移模型,繼續(xù)飼養(yǎng),并觀察、記錄小鼠一般生長情況,10周后對比兩組小鼠體內轉移病灶形成率、轉移病灶體積。研究結果1.DNA-PKcs抑制劑NU7026作用于骨肉瘤細胞后,細胞的遷移和侵襲能力明顯降低,與陰性對照組相比,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),說明DNA-PKcs具有促進骨肉瘤細胞體外遷移和侵襲的作用。2.按照合適的MOI值,DNA-PKcs siRNA慢病毒載體感染四種骨肉瘤細胞,感染效率均可達80%以上。qRT-PCR和Western Blot結果顯示,與感染陰性對照siRNA慢病毒載體的細胞相比,感染DNA-PKcs siRNA慢病毒載體的骨肉瘤細胞中DNA-PKcs mRNA和蛋白水平均顯著降低(P0.05),DNA-PKcs基因沉默效果滿意。3.下調DNA-PKcs表達后,骨肉瘤細胞中MMP2和p-MLC2蛋白白表達水平顯著降低,細胞上清中MMP2的分泌量顯著減少(P0.05),說明DNA-PKcs可以通過調節(jié)MMP2和p-MLC2的表達參與骨肉瘤細胞體外遷移和侵襲。4.下調DNA-PKcs表達后,具有活性的RhoA-GTP酶表達降低,H.ROCK2在mRNA和蛋白水平均有下降,與陰性對照組相比,具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),說明DNA-PKcs對RhoA/ROCK2信號通路具有調節(jié)作用。5.采用ROCK2抑制劑SLx-2119作用于骨肉瘤細胞后,細胞體外遷移和侵襲能力均顯著降低(P0.05);siRNA下調ROCK2表達后,細胞中MMP2和P-MLC2蛋白的表達顯著降低,細胞上清中MMP2的分泌量顯著減少(P＜0.05)。該結果說明,RhoA/ROCK2信號通路可以通過MMP2和p-MLC2促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。6.與陰性對照siRNA慢病毒載體感染的MNNG/HOS細胞相比,DNA-PKcs siRNA慢病毒載體感染的MNNG/HOS細胞在NOD/SCID小鼠體內形成的轉移病灶數(shù)量明顯減少,且腫瘤平均體積減小,兩組相比具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。該結果表明,DNA-PKcs具有促進骨肉瘤體內轉移形成和發(fā)展的作用。結論1.DNA-PKcs具有促進骨肉瘤細胞體外遷移和侵襲、體內轉移瘤形成和發(fā)展的作用。2.DNA-PKcs可以通過RhoA/ROCK2信號通路調節(jié)MMP2和p-MLC2的表達,促進骨肉瘤細胞轉移。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R738.1

【參考文獻】

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本文編號：1717564