發(fā)布時間：2018-04-01 09:13

  本文選題：miRNA-155　切入點：吸入性肺損傷　出處：《河北北方學院》2017年碩士論文

【摘要】：據(jù)統(tǒng)計,約5%~10%燒傷患者并發(fā)吸入性肺損傷,重度死亡率可達80%以上,是早期燒傷患者主要的死因之一。雖然針對吸入性損傷的研究一直是國內(nèi)外研究的熱點,但其關鍵因素始終未能得到突破性進展,從而導致其死亡率居高不下。因此,對肺損傷的確切發(fā)病機制及有效的主動性干預措施的研究實屬必要。研究發(fā)現(xiàn),在急性肺損傷的發(fā)病機制中核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)有著重要作用。特異性抑制NF-κB信號通路的活化可減少炎癥的級聯(lián)放大,控制吸入性損傷的病變程度及減緩疾病進程。然而,由于NF-κB作用的時間和空間上的特異性,NF-κB信號通路的抑制劑尚未取得成功。微小RNA(microRNAs,miRNAs)技術的出現(xiàn),為這一難題的解決提供了可能。miRNAs是具有調(diào)節(jié)作用小分子非編碼RNA,能夠與靶mRNA的3’非編碼區(qū)特異性結合,介導翻譯抑制或誘導降解,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。miRNAs在抑制腫瘤細胞生長以及免疫方面的作用已經(jīng)引起廣泛關注,然而,關于miRNAs在煙霧吸入性急性肺損傷的相關功能研究鮮有報道。miR-155是miRNAs重要一員,在免疫及炎癥方面具有重要的作用,但在煙霧吸入性急性肺損傷研究尚未見報道。活化性T淋巴細胞核因子5(nuclear factor of the activated T cell 5,NFAT5)屬于Rel家族蛋白,因參與滲透壓的調(diào)節(jié)而被大家所了解。此外,NFAT5還可誘導促炎因子的表達,促進炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。因此,我們猜測既然炎癥發(fā)生、發(fā)展與煙霧吸入性急性肺損傷有關,那么NFAT5是否也與煙霧吸入性急性肺損傷的發(fā)病機制有關?其相關研究國內(nèi)外尚未報道。本實驗采用大鼠煙霧吸入性急性肺損傷模型,在基因及分子水平對煙霧吸入性急性肺損傷的發(fā)病機制進行研究,探究:(1)NFAT5是否參與了煙霧吸入性肺損傷?(2)NFAT5功能的調(diào)控因子miR-155的篩選及功能驗證。(3)NFAT5在煙霧吸入性急性肺損傷發(fā)病機制的作用。我們首先建立煙霧吸入性急性肺損傷大鼠動物模型,并通過miRNA芯片檢測和表達譜芯片檢測尋找出差異性表達的miRNAs和基因(miR-155和NFAT5)。通過體內(nèi)及體外實驗正反兩方面研究NFAT5在煙霧吸入性急性肺損傷中的功能研究。具體的研究方法如下:1、煙霧吸入性急性肺損傷大鼠動物模型建立:使用自制煙霧吸入性損傷儀,建立大鼠煙霧吸入性急性肺損傷模型,通過肺組織HE染色、肺組織濕干比及COX2的Western blot進行驗證;2、miR-155、NFAT5的篩選及相關分析:選煙霧致傷和正常大鼠各3只,煙霧致傷24小時后,對肺組織進行microRNA芯片檢測和表達譜芯片檢測(miRNA4.0芯片數(shù)據(jù)及RTA芯片數(shù)據(jù)),篩選出差異表達明顯的miRNA及對應的靶基因;3、細胞水平對miR-155與NFAT5靶向關系的研究:利用生物信息學方法預測其靶基因;采用基因工程手段構建靶基因-熒光素酶報告質(zhì)粒,并通過雙熒光素酶實驗鑒定miRNA與靶基因mRNA 3’-UTR是否互補結合;4、miR-155功能的研究:將大鼠分為A:正常對照組:煙霧吸入性損傷組+安慰劑(生理鹽水)、B:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155control、C:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 mimics、D:煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 inhibitors,轉(zhuǎn)導治療24小時后,通過病理HE染色、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)(炎癥因子(Tumor Necrosis Factor-alpha(TNF-α)、monocyte chemotactic peptide-1(MCP-1)、(Interleukin-IL)-1β、IL-8))、實時定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)(TNF-α、IL-1β)、COX2的Western blot等方法研究miR-155是否能夠減輕肺損傷及降低肺組織炎性分子的表達;5、NFAT5在煙霧吸入性肺損傷中的實驗研究:對煙霧致傷組和正常對照組大鼠,行Western blot和RT-PCR檢測NFAT5的表達情況;并對轉(zhuǎn)導治療中各分組行Western blot檢測NFAT5、P-P65、P65、COX2的表達情況;最后對基因敲除小鼠和正常小鼠煙霧致傷后24小時,行病理HE染色和Western blot檢測NFAT5、P-P65和COX2,進一步驗證靶基因及相關通路蛋白在煙霧吸入性肺損傷中作用。結果:1、成功建立大鼠煙霧吸入性急性肺損傷動物模型:病理結果顯示煙霧致傷組明顯的炎細胞浸潤、充血及肺泡改變;肺濕干比及COX2的灰度值均顯示煙霧致傷組大于正常組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);2、miR-155、NFAT5參與煙霧吸入性急性肺損傷,且miR-155對NFAT5具有靶向調(diào)控趨勢:miRNA芯片篩選得到了47個差異表達的miRNA具有統(tǒng)計學意義(P0.05),表達上調(diào)和下調(diào)的分別為24和23個,超過2倍顯著差異表達的miRNAs包括:表達上調(diào)的miR-449a-5p、miR-205、miR-155-5p和表達下調(diào)的miR-92b-5p、miR-667-5p、miR-708-5p。上調(diào)的miRNAs中miR-155表達明顯上調(diào)3.46倍;RTA芯片檢測篩選得到共有30種基因差異表達具有統(tǒng)計學意義(P0.05),表達上調(diào)的有AKR1B10、CXCL13、VSIG4和表達下調(diào)的PLP2、SCD1、NFAT5、ATP6VB2等,且miRNA芯片和RTA芯片聯(lián)合分析結果顯示miR-155對NFAT5具有靶向調(diào)控趨勢;3、miR-155對NFAT5基因mRNA 3’-UTR具有靶向調(diào)控作用:Mirbase、TargetScan、PicTar預測交叉結果顯示,NFAT5基因3’UTR與miR-155存在結合互補位點;構建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確;雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)顯示:pMIR-NFAT5+miR155 mimics組較pMIR-NFAT5+miR-control組熒光素酶活性降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);4、miR-155能減弱煙霧致傷大鼠的肺損傷和全身炎癥反應:病理檢測結果顯示煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 mimics大鼠肺組織的炎癥充血、炎癥細胞的浸潤及肺泡結構破環(huán)程度較煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 control和煙霧吸入性損傷組+miRNA-155inhibitors明顯弱,僅次于正常對照組;ELISA、Western blot、RT-PCR等證實了過表達miR-155可以減弱煙霧導致急性肺損傷相關蛋白COX2和炎癥因子(TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-8)的表達(P0.05)。5、NFAT5加重煙霧吸入性急性肺損傷:Western blot和RT-PCR檢測煙霧致傷組和正常對照組大鼠NAFT5結果顯示煙霧致傷組的高于正常對照組,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01);煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 control、煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 mimics、煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 inhibitors三組大鼠肺組織標本W(wǎng)estern Blot結果示煙霧吸入性損傷組+miRNA-155mimics大鼠肺組織NFAT5、P-P65、P65、COX2四種蛋白表達明顯低于煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 control和煙霧吸入性損傷組+miRNA-155 inhibitors;NFAT5基因敲除小鼠和正常小鼠煙霧致傷后24小后,病理檢測顯示NFAT5-KO小鼠較正常鼠損傷明顯減輕;NFAT5、P-P65和COX2等蛋白Western Blot結果顯示NFAT5基因敲除組肺組織NFAT5、P-P65和COX2三種蛋白表達明顯低于正常組(P0.01)。結論:1、NFAT5在煙霧吸入性急性肺損傷中發(fā)揮重要的生物學作用,其通過激活NF-κB信號通路加速病情進展;2、抑制NFAT5的表達能夠減輕煙霧吸入性急性肺損傷;miR-155可負性調(diào)控NFAT5,從而減弱肺損傷;
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【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R644

【參考文獻】

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本文編號：1694892