本文選題：成骨細(xì)胞　切入點(diǎn)：降鈣素基因相關(guān)肽　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：一、研究背景在骨折愈合過程中,成骨細(xì)胞是骨修復(fù)和骨重建最為重要的細(xì)胞之一,主要依賴于微環(huán)境中連綿不絕的營養(yǎng)供應(yīng)及促生存信號才能維持其正常的生理功能;當(dāng)骨組織發(fā)生病變或者損傷導(dǎo)致營養(yǎng)因子供應(yīng)受到限制時(shí),成骨細(xì)胞將會發(fā)生超出正常生理狀態(tài)的凋亡率,由此對骨的重塑造成了嚴(yán)重的影響。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)骨組織的各項(xiàng)生理功能,降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)作為廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì),對骨形成和骨吸收起著重要的作用。本課題組在前期研究中已經(jīng)證實(shí)CGRP在頜骨骨折的愈合過程中起著重要的促進(jìn)作用。成骨細(xì)胞表面存在CGRP受體,CGRP通過結(jié)合受體發(fā)揮對成骨細(xì)胞活性的直接調(diào)節(jié)作用,CGRP對成骨細(xì)胞的作用分子機(jī)制已有大量研究。近期研究證明CGRP能夠通過抑制成骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)而抑制骨的丟失,對成骨細(xì)胞具有潛在的保護(hù)作用,但具體機(jī)制尚不完全清楚。自噬(autophagy)是一種細(xì)胞應(yīng)對不利環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制,是將受損或異常的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)通過雙層膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)至溶酶體降解循環(huán)再利用的過程。凋亡(apoptosis)是細(xì)胞受基因控制的一種主動的有序的死亡方式。骨折愈合過程中同時(shí)伴隨著凋亡與自噬的發(fā)生,兩者如何互相作用共同促進(jìn)骨折愈合的具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證CGRP對饑餓條件下成骨細(xì)胞抗凋亡作用,發(fā)現(xiàn)其對饑餓條件下成骨細(xì)胞自噬活性的影響作用,再對兩者相互的關(guān)系進(jìn)行了初步的探索。首次從自噬入手,試圖進(jìn)一步揭示CGRP對成骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。二、研究方法成骨細(xì)胞于血清饑餓條件(α-MEM培養(yǎng)基、0%FBS、100U/ml青-鏈霉素)下培養(yǎng)12h、24h后通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting分別檢測其凋亡率和自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)。自噬抑制劑3-MA預(yù)處理成骨細(xì)胞細(xì)胞1h后血清饑餓培養(yǎng)24h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。在血清饑餓條件下加入不同濃度的CGRP培養(yǎng)24h,采用Western blotting檢測LC3蛋白和P62蛋白,篩選出對自噬優(yōu)勢作用濃度;通過加入CGRP后不同時(shí)間段采用Western blotting檢測LC3蛋白,篩選出CGRP作用于饑餓條件下成骨細(xì)胞自噬作用的優(yōu)勢作用時(shí)間段。CGRP作用于血清饑餓條件下培養(yǎng)成骨細(xì)胞24h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,并采用共聚焦激光顯微鏡觀察MDC染色細(xì)胞自噬體和LC3免疫熒光染色。在血清饑餓條件下使用自噬抑制劑抑制3-MA預(yù)處理細(xì)胞后加入CGRP培養(yǎng)24h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。三、研究結(jié)果1.血清饑餓會誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡率升高,通過Western blot檢測顯示血清饑餓會誘導(dǎo)成骨細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高。2.自噬抑制劑3-MA預(yù)處理可以增加血清饑餓條件下成骨細(xì)胞凋亡率。3.CGRP可以抑制血清饑餓誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡。CGRP作用于血清饑餓條件下成骨細(xì)胞24h,隨著加入CGRP濃度的逐漸升高,LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異逐漸上升,P62表達(dá)逐漸下降,在CGRP濃度為10-8mol/L是差異較為明顯。CGRP作用于血清饑餓條件下成骨細(xì)胞不同時(shí)間段,在24h時(shí)LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異最為明顯。CGRP誘導(dǎo)血清饑餓條件下成骨細(xì)胞自噬體形成及LC3蛋白表達(dá)。4.自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后可以增加血清饑餓條件下成骨細(xì)胞的凋亡率,CGRP則能部分逆轉(zhuǎn)自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后所致的血清饑餓條件下成骨細(xì)胞的凋亡。四、結(jié)論1.本研究驗(yàn)證血清饑餓會誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡及自噬活性的升高,抑制血清饑餓條件下成骨細(xì)胞的自噬活性會誘導(dǎo)凋亡率的升高。2.本研究證實(shí)CGRP抑制血清饑餓誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡的同時(shí)誘導(dǎo)血清饑餓條件下成骨細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)。本研究證實(shí)CGRP能部分逆轉(zhuǎn)自噬抑制所致的血清饑餓條件下成骨細(xì)胞的凋亡,可能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬活性。
[Abstract]:In this study , calcitonin gene - related peptide ( CGRP ) plays an important role in bone formation and bone resorption .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R683

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本文編號：1673873