本文選題：miR-185　切入點：HMSCs　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：一、研究的背景骨缺損常見于外傷、骨腫瘤等原因,缺損的修復(fù)是目前骨外科最常見的問題之一,特別是大片骨的缺損,更是臨床上骨修復(fù)面臨的一大難題。目前的修復(fù)主要有自體骨修復(fù)、異體骨修復(fù)和人工骨修復(fù)幾種方式,自體內(nèi)修復(fù)因來源不足并且要面臨再次缺損和感染的風(fēng)險,臨床上應(yīng)用有限；異體骨主要問題是免疫排斥難以成活等原因也比較少用；而人工骨避免了以上二種情況的缺點,被臨床大量應(yīng)用。但就目前而言,人工骨也面臨著缺少生物活性等缺點,現(xiàn)在很多科學(xué)家正在尋找新的方法,在實驗室里培育具有活性的人工生物骨材料,來為臨床骨缺損提供理想骨性替代材料。目前生物骨性材料的研究主要是種子細胞和細胞附著物。細胞一般有胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞和成體細胞,而細胞附著物一般是有骨特性的物質(zhì),如羥灰石,凝膠,也有我們常見的鈦片。主要是將這些細胞附著在這些物體上,然后加以誘導(dǎo)培養(yǎng),讓這些細胞變成為某一組織器官的細胞,以達到器官缺失或功能的修補。最近常聽說人造耳朵或人造某某器官,就是用此方法得來的。就目前用作培養(yǎng)的細胞而言,胚胎干細胞因為取之不方便,培養(yǎng)條件要求高,多向分化功能強大不好控制(實驗室常見會自動分化成不同的細胞,如心肌細胞等),再加上倫理等原因,其實很少被用來當(dāng)作誘導(dǎo)細胞,而成體細胞因其高度分化,在培養(yǎng)環(huán)境下容易老化,也很少被作用研究使用。而間充質(zhì)干細胞,因其有分化能力,取之方便(很容易自身提取),無倫理道德之約束,容易培養(yǎng)而被廣泛用作人工材料的研究。如何在實驗室里將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)成我們的目的細胞,并且具備一定的功能,越來越多的科研工作者對此十分感興趣,并逐步深入研究,有的已取得一定的成果。就間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)而言,已有很多研究者作出了大量的工作,他們在研究的過程中發(fā)現(xiàn)一些基因在干細胞成骨分化上起到一定的作用,如內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等一些因子,在分化過程當(dāng)中起到非常重要的作用。然而研究者們更深入的研究發(fā)現(xiàn),在這些因子影響細胞的同時,還有一類小分子也在調(diào)控著這些基因,這些小分子就是1microRNA。microRNA (miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié),一般通過靶基因的3’端非翻譯區(qū)部分互補配對的結(jié)合方法來調(diào)節(jié)調(diào)控基因。在生物的生命進程中,廣泛參與細胞增殖,生長發(fā)育,細胞分化及器官形成等。在生物體生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。特別是在干細胞的多向分化的調(diào)控作用上,有著非常明顯的變化,并且越來越受到關(guān)注。miRNA是由Lee等在1993年研究線蟲的發(fā)育過程當(dāng)中首先發(fā)現(xiàn)的,它們是一類非編碼的小分子RNA,它們廣泛存在于植物和動物體內(nèi),長度為19～25個核苷酸。這些長為20nt左右的RNA是被最終剪接而成的成熟體。起初它們在細胞核中轉(zhuǎn)錄成初級產(chǎn)物,這些產(chǎn)物被一種叫作RNase Ⅲ Drosha的酶切割成前體,它們的前體是由大約90nt的小分子RNA組成的一個發(fā)夾結(jié)構(gòu),并且在exPortin-5蛋白的作用下,被從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)里面來,最后被RNase Ⅲ Dicer進一步切割,然后變成成熟體,成熟體與其它的蛋白結(jié)合,形成RISC復(fù)合體,然后一起作用于目的基因的3’端,互補結(jié)合,起到抑制目的基因表達的作用,但最新的研究也發(fā)現(xiàn),有些miRNA還可以與目的基因的啟動區(qū)結(jié)合,起到促進目的基因表達的作用,但目前所發(fā)現(xiàn)的一千多個miRNA來說,絕大多數(shù)是在目的基因3’端結(jié)合,起到調(diào)控目的基因表達的。在對miRNA的研究中,很多科研工作者已發(fā)現(xiàn)了一些miRNA的重要作用,如miR-185不僅對分化產(chǎn)生影響,而且還對細胞耐輻射有一定的作用。還有如miR-21對細胞的凋亡有很明顯的作用,很多人設(shè)想將其用于癌癥治療。還有一些小分子對器官的發(fā)育有一定的作用。由于miRNA在不同的條件下表達水平不一樣,比如細胞癌變時,表達高,正常細胞表達低,現(xiàn)在有臨床上把有些miRNA作為愈后的一項指標(biāo)來判斷疾病的康復(fù)情況。就轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1而言,已有實驗證明它在干細胞分化的過程當(dāng)中起到重要的作用,不僅在成肝細胞、成心肌細胞起到重要的作用,且在成骨誘導(dǎo)方面也有所報道,這說明轉(zhuǎn)化生長因子在生命進程中,對分化起到重要的作用。然而,我們知道,生命的進程最終是走向衰老的,這是不是說明在分化過程中,轉(zhuǎn)化因子的作用慢慢減退了,這讓我們想到了是不是有什么在調(diào)控這些因子的作用,而最新的miRNA可以調(diào)控基因的成果提示我們,會不會是因為miRNA的作用而使基因的功能減弱呢?帶著疑問,我們利用mirBASB進行查詢,發(fā)現(xiàn)miR-185與TGF-β1有潛在調(diào)控位點,再查詢了最新的文獻發(fā)現(xiàn)目前沒有這方面的報道,鑒于以上好奇,于是我們選用miR-185展開研究。二、研究的內(nèi)容首先我們從基因組中克隆出了miR-185,將克隆片段連接到慢病毒載體上,然后連同其它包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入慢病毒包裝細胞293T細胞里,包裝成慢病毒顆粒,然后再去感染人骨髓間充質(zhì)干細胞,通過篩選得到穩(wěn)定細胞株,增殖并備用。然后我們化學(xué)合成了干擾片段,將miR-185沉默掉,轉(zhuǎn)入人骨髓間充質(zhì)干細胞作為反向?qū)φ?看miR-185在細胞成骨分化中所起的作用。同時,我們包裝了不含miR-185而只含GFP的病毒作為對照組,展開實驗。1、過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用目的：檢測過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力方法：構(gòu)建過表達miR-185和抑制miR-185的慢病毒載體,包裝成可以感染目的細胞的慢病毒顆粒,分別感染HMSCs細胞,將細胞分別設(shè)為三組,并在成骨分化誘導(dǎo)液里誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后,分別行茜素紅染色,觀察成骨情況,并進行定量分析(圖3-5、圖3-6)。結(jié)果：通過茜素紅染色表明,過表達miR-185對細胞成骨分化有明顯的抑制作用,而抑制miR-185的表達,對細胞成骨分化顯著增強。這些結(jié)果表明,miR-185在細胞成骨分化中起到重要的調(diào)節(jié)作用。結(jié)論：上調(diào)miR-185表達能夠降低干細胞的成骨分化能力,抑制miR-185表達顯著增強干細胞成骨分化能力。2、過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞堿性磷酸酶活性影響目的：檢測過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞ALP活性能力方法：將感染了表達miR-185和抑制miR-185慢病毒的細胞,分別設(shè)為三組,并在成骨分化誘導(dǎo)液里誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,進行ALP染色并處理細胞測OD值,作定量分析。結(jié)果：實驗顯示,抑制miR-185組染色明顯要比過表達miR-185實驗組深,同時酶標(biāo)儀測OD值提示,抑制組的活性顯著高于過表達組,結(jié)果表明,在體外實驗中,miR-185可能起到調(diào)節(jié)細胞基因的重要作用(圖3-7、圖3-8)。結(jié)論：上調(diào)miR-185表達能夠降低細胞的堿性磷酸酶活性,抑制miR-185表達顯著增強細胞堿性磷酸酶活性(P0.05)。3、過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨相關(guān)基因水平的影響目的：檢測過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞基因OCN、 OSterix、OPN表達水平。方法：將感染了表達miR-185和抑制miR-185慢病毒的細胞,分別設(shè)為三組,并在成骨分化誘導(dǎo)液里誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后,收集細胞并提取RNA,采用基因定量技術(shù)(QPCR)檢測不同組別OCN、OSterix、OPN表達水平。結(jié)果：基因定量檢測結(jié)果表明,相對于對照組,過表達miR-185組對成骨特性基因OCN、OSterix、OPN表達水平低(圖3-9)；而在抑制miR-185組中,相對于對照組,OCN、OSterix、OPN表達水平顯著要高(圖3-10)。結(jié)果表明,miR-185可能在對細胞影響或促進分化的基因起到一定的調(diào)控作用。結(jié)論：上調(diào)miR-185表達能夠降低成骨特性基因OCN、OSterix、OPN表達水平,抑制miR-185表達則基因OCN、OSterix、OPN的表達顯著提高(P0.05)。4、過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨相關(guān)蛋白的影響目的：檢測過表達miR-185和抑制miR-185對人骨髓間充質(zhì)干細胞OCN、DMP1、OPN蛋白表達水平。方法：將感染了表達miR-185和抑制miR-185慢病毒的細胞,分別設(shè)為三組,并在成骨分化誘導(dǎo)液里誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后,收集細胞并抽提蛋白,采用WB技術(shù)檢測不同組另OCN、DMP1、OPN蛋白表達水平。結(jié)果：WB檢測結(jié)果表明,相對于對照組,過表達miR-185組對成骨特性基因OCN、 DMP1、表達水平低,OPN的表達則不太明顯；而在抑制miR-185組中,相對于對照組,OCN、DMP1、OPN表達水平顯著要高(圖3-11、圖3-12))。結(jié)果表明,miR-185在成骨分化中扮演重要的調(diào)控基因的作用。結(jié)論：上調(diào)miR-185表達能夠降低蛋白OCN、DMP1表達水平,抑制miR-185表達則蛋白OCN、DMP1、OPN的表達顯著提高(P0.05)。5、miR-185與TGF-β1調(diào)控關(guān)系檢測目的：探尋miR-185在基因調(diào)控中針對靶基因TGF-β1調(diào)節(jié)作用。方法：使用TargetScan軟件工具miR-185目標(biāo)預(yù)測分析表明,TGF-β1是miR-185潛在目標(biāo)(圖4-2)。為了進一步驗證miR-185與TGF-β1相互之間存在的關(guān)系,我們克隆了TGF-β1 3'UTR片段,含有miR-185結(jié)合位點的PGL3熒光素酶載體,同時我們克隆了TGF-β1 3'UTR突變載體,具體突變了二個堿基,見(圖4-3)。通過熒光素酶活性檢測表明,miR-185過表達組明顯低于對照組。結(jié)果：熒光素酶檢測表明,miR-185過表達與對照組中熒光值存在明顯差異性(P0.01),而在突變體卻無此差異性。結(jié)論：基因TGF-β1是miR-185調(diào)控靶基因。統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。兩個樣本均數(shù)比較采用Independent-SampleTtest進行檢驗,多個樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA分析,多樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD法,結(jié)果柱狀圖中的誤差條均為標(biāo)準(zhǔn)差,檢驗水準(zhǔn)P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R68

【共引文獻】

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本文編號：1665265