本文關(guān)鍵詞： 殼聚糖緩釋微球 骨組織工程 骨缺損 納米羥基磷灰石/膠原骨 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1　出處：《青島大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的在實(shí)驗(yàn)室中自行制備轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/殼聚糖緩釋微球、納米羥基磷灰石/膠原支架材料及負(fù)載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/殼聚糖緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原支架材料。然后分別以單純支架材料及負(fù)載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/殼聚糖緩釋微球的支架材料應(yīng)用于兔橈骨骨缺損的修復(fù)。通過(guò)觀察術(shù)后各個(gè)固定時(shí)間段骨缺損區(qū)成骨修復(fù)情況,來(lái)證實(shí)納米羥基磷灰石/膠原骨修復(fù)兔橈骨骨缺損的能力及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在骨組織修復(fù)過(guò)程中的效應(yīng)。為應(yīng)用骨組織工程方式臨床修復(fù)大塊骨缺損探尋一種有效的方法。研究方法1.應(yīng)用乳化交聯(lián)法制備負(fù)載TGF-β1的殼聚糖緩釋微球,并對(duì)TGF-β1殼聚糖緩釋微球的外觀形態(tài)、載藥量、包封效率及體外釋放情況進(jìn)行分析。2.制備納米羥基磷灰石/膠原骨及納米人工骨/TGF-β1殼聚糖緩釋微球復(fù)合人工骨,并對(duì)兩種人工骨進(jìn)行掃描電鏡觀察、孔隙率、力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)定。3.選擇普通新西蘭大白兔45只,雙側(cè)橈骨手術(shù)建立10mm骨缺損模型,同時(shí)將單純納米羥基磷灰石/膠原骨支架材料植入左側(cè)橈骨骨缺損中,設(shè)定為對(duì)照組;將負(fù)載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/殼聚糖緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原支架材料植入右側(cè)橈骨骨缺損中,設(shè)定為實(shí)驗(yàn)組。在手術(shù)后的第2周、第4周、第6周、第8周、第12周時(shí)間段,每次隨機(jī)從45只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中選取9只處死,對(duì)其雙前肢行X射線拍照、缺損手術(shù)區(qū)行骨密度測(cè)定及病理切片組織學(xué)分析,對(duì)各個(gè)不同時(shí)期骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行評(píng)估。對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的不同評(píng)估數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、對(duì)比,從而證實(shí)兩種不同支架材料修復(fù)骨缺損的效果是否存在差異。結(jié)果制備的TGF-β1/殼聚糖緩釋微球的性狀:微球呈淡黃色粉末狀。掃描電鏡觀察到所制備的TGF-β1殼聚糖微球基本呈類球形,大小均勻,直徑約為5μm,表面光滑,有較多微小孔隙,分散度較好。TGF-β1/殼聚糖緩釋微球的載藥量和包封率測(cè)定結(jié)果:共放入TGF-β1的量為5μg,TGF-β1殼聚糖微球10mg溶解后制備得到的上清液樣本以人TGF-β1 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè),TGF-β1殼聚糖微球的載藥量為22.9μg/g,包封率為79.5%。TGF-β1殼聚糖微球體外釋放情況:在前12小時(shí)內(nèi)TGF-β1因子釋放速度較快,以后逐漸平緩,到第6天,TGF-β1殼聚糖微球釋放量為55.5%。大體觀察:在手術(shù)后2周時(shí),在實(shí)驗(yàn)側(cè)手術(shù)部位支架材料的輪廓是清晰的,觸之感覺(jué)其硬度增加,其與兔橈骨的兩端連接部位連接牢固。而對(duì)照組支架材料輪廓也清晰,局部觸之無(wú)明顯變硬,連接部位連接無(wú)實(shí)驗(yàn)側(cè)牢固,但未出現(xiàn)移位情況;手術(shù)后第4周,切口處支架材料的輪廓已不明顯,實(shí)驗(yàn)側(cè)手術(shù)部位已看不到輪廓。人工骨與宿主骨斷端間結(jié)合更加緊密,移植材料體表觸感質(zhì)地更加堅(jiān)硬。對(duì)照側(cè)納米骨與宿主骨間連接緊密程度及堅(jiān)硬程度較實(shí)驗(yàn)組差;術(shù)后第6周,實(shí)驗(yàn)側(cè)人工骨與宿主骨斷端間可捫及隆起骨痂,質(zhì)地變硬。對(duì)照側(cè)支架材料與橈骨交界處也可以觸及新形成的骨痂,但是其大小及硬度均不如實(shí)驗(yàn)側(cè);手術(shù)后第8周,實(shí)驗(yàn)側(cè)支架材料外部也變硬,形成包殼樣結(jié)構(gòu),支架材料與橈骨交界處形成的骨痂觸之更加堅(jiān)硬,連接部位結(jié)合已十分牢固,對(duì)照側(cè)也可捫及硬的包殼及骨痂,但其硬度不如實(shí)驗(yàn)側(cè),其連接部位結(jié)合也比較牢固;手術(shù)后第12周,實(shí)驗(yàn)側(cè)的支架材料處外部觸之已十分堅(jiān)硬,交界處的骨痂已基本觸不到,手術(shù)區(qū)骨質(zhì)與宿主骨觸之已十分相似,對(duì)照側(cè)較實(shí)驗(yàn)側(cè)為差。X射線觀察:觀察內(nèi)容包括骨形成、骨連接及骨塑形3個(gè)方面11項(xiàng)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)側(cè)在術(shù)后2周即有成骨表現(xiàn),但成骨部分占骨缺損部分比例不到25%,交界處可見(jiàn)少許骨痂形成,分界線模糊,未見(jiàn)骨塑形情況;對(duì)照側(cè)未見(jiàn)明顯成骨表現(xiàn),交界處分界線清晰,無(wú)骨塑形情況。4周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)有部分骨痂形成,成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)到25%,但不足50%,交界處可見(jiàn)部分骨痂形成,分界線更為模糊,但未消失,未見(jiàn)明顯骨塑形情況;對(duì)照側(cè)可見(jiàn)成骨表現(xiàn),但成骨部分占骨缺損部分比例不到25%,交界處分界線模糊,無(wú)骨塑形情況。6周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)有大量骨痂形成,成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)50%,但未超過(guò)75%,植入骨與宿主骨接觸間隙極為模糊至基本消失,未見(jiàn)正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形;對(duì)照側(cè)成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)到25%,但不足50%,交界處可見(jiàn)有少許骨痂形成,分界線已經(jīng)模糊,未見(jiàn)正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨痂進(jìn)一步增加,成骨占骨缺損部分比例達(dá)75%以上,但骨缺損未完全愈合,植入骨與宿主骨接觸間隙基本消失,可見(jiàn)到髓腔樣結(jié)構(gòu)形成但無(wú)皮質(zhì)骨塑形表現(xiàn);對(duì)照側(cè)也有大量骨痂形成,成骨部分占骨缺損部分比例達(dá)50%,但未超過(guò)75%,植入骨與宿主骨接觸間隙極為模糊,未見(jiàn)正常髓腔形成及皮質(zhì)骨塑形。12周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨缺損全部愈合,新生骨完全填充骨缺損部位,移植骨-宿主骨間隙完全消失,髓腔再通,皮質(zhì)骨已經(jīng)塑形成為成熟的板層骨;對(duì)照側(cè)骨痂進(jìn)一步增加,新生骨占骨缺損部分比例達(dá)75%以上,但骨缺損未完全愈合,植入骨與宿主骨接觸間隙基本消失,可見(jiàn)到髓腔樣結(jié)構(gòu)形成但無(wú)皮質(zhì)骨塑形表現(xiàn)。骨密度測(cè)定:骨密度,全稱“骨骼礦物質(zhì)密度”。骨密度是骨質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志。手術(shù)后第2周對(duì)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨缺損區(qū)行骨密度測(cè)定,發(fā)現(xiàn)骨缺損區(qū)支架材料骨密度值比體外制備的納米支架材料骨密度值增高;并在隨后的第4周、第6周、第8周及第12周行骨密度測(cè)定,其數(shù)值均高于體外納米支架材料的骨密度數(shù)值,并且其骨密度值隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增高,尤其在術(shù)后第12周,骨缺損區(qū)的骨密度測(cè)定數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物橈骨本身骨密度數(shù)值達(dá)到同一水平。而在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的對(duì)照側(cè),骨缺損區(qū)的骨密度數(shù)值高于體外納米支架材料密度出現(xiàn)在術(shù)后第4周。在隨后的幾個(gè)時(shí)間段其骨缺損區(qū)骨密度數(shù)值也隨時(shí)間而增高,但是即便在第12周時(shí),缺損區(qū)骨密度數(shù)值也低于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物橈骨本身的骨密度數(shù)值。組織學(xué)觀察:實(shí)驗(yàn)側(cè)在術(shù)后2周即表現(xiàn)活躍成骨,成骨類細(xì)胞增加,局部開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積,對(duì)照組的成骨活躍程度較實(shí)驗(yàn)組要差;復(fù)合支架材料的實(shí)驗(yàn)組在手術(shù)后第2周病理切片局部可以觀察到在材料周邊有骨痂形成,隨時(shí)間推移,在以后的第4周、第6周、第8周時(shí)間段,骨痂的數(shù)量逐漸增多,組織學(xué)結(jié)構(gòu)“骨單位”開(kāi)始形成并出現(xiàn),骨單位逐漸增多并成熟。納米支架材料在體內(nèi)逐漸被降解、吸收,破骨細(xì)胞對(duì)新生骨進(jìn)行改建,髓腔結(jié)構(gòu)逐漸形成,在手術(shù)后的第12周,骨單位均已十分成熟,大量板層骨在骨缺損區(qū)形成,板層骨已經(jīng)取代了排列雜亂的新生骨,髓腔再通,局部骨缺損得以修復(fù),新骨與宿主骨已完全結(jié)合,塑形完成。單純支架材料的對(duì)照側(cè)在材料周邊病理切片觀察到新生骨出現(xiàn)在手術(shù)后第4周,其進(jìn)程與實(shí)驗(yàn)側(cè)成骨進(jìn)程相似,但在同一時(shí)間段,對(duì)照側(cè)的成骨數(shù)量及新生骨的成熟度均較實(shí)驗(yàn)側(cè)差,在術(shù)后第12周時(shí),雖然出現(xiàn)的骨單位結(jié)構(gòu)也逐漸成熟,并且逐漸增多的大量骨痂填充骨缺損區(qū),但新骨的改建及塑形還沒(méi)有完成,髓腔結(jié)構(gòu)剛剛開(kāi)始形成,沒(méi)有形成大量成熟的板層骨。結(jié)論1.采用乳化交聯(lián)方法制備復(fù)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的殼聚糖緩釋微球的方法簡(jiǎn)便易行,成球性好,獲取率高,具有優(yōu)良的緩釋效果。2.TGF-β1對(duì)創(chuàng)傷、腫瘤、先天畸形等原因?qū)е碌墓侨睋p的修復(fù)、骨組織的生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著積極的效應(yīng)。其發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制是TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化、微血管形成及細(xì)胞外基質(zhì)的形成有一定的促進(jìn)作用。在骨組織工程的應(yīng)用中有著重要的意義。3.復(fù)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/殼聚糖緩釋微球的納米晶膠原基骨(n HAC)是一種良好的修復(fù)骨缺損的骨組織工程材料。4.單純納米支架材料本身也是優(yōu)良的骨缺損修復(fù)材料,它可以直接植入骨缺損區(qū)作為支架材料,橋接骨缺損區(qū)的周邊骨質(zhì),誘導(dǎo)新骨形成并修復(fù)骨缺損;同時(shí),它也可以作為骨組織工程的載體,將種子細(xì)胞或細(xì)胞因子與其復(fù)合,從而更加有效的修復(fù)和治療骨缺損。
[Abstract]:In order to investigate the effect of nano - hydroxyapatite / collagen scaffold on bone defects in rabbits , the effect of nano - hydroxyapatite / collagen scaffold on repairing bone defects in rabbits was studied . The results showed that there was no obvious bone formation at the interface between artificial bone and host bone . Bone mineral density ( BMD ) and bone mineral density ( BMD ) in the bone defect area were more than 75 % , but not more than 75 % . The results showed that TGF - 尾1 could be used as scaffold material in the treatment of bone defects . thereby more effectively repairing and treating bone defects .

【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R687;R318.08

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