本文關鍵詞： β-catenin 脊髓源性神經(jīng)干細胞 增殖 分化　出處：《重慶醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的從CD1胎鼠脊髓中提取神經(jīng)干細胞(Neural stem cells,NSCs)并對細胞進行鑒定,探討β-catenin基因對脊髓源性神經(jīng)干細胞的作用,為進一步體內(nèi)試驗提供理論基礎。方法將E14的CD1孕鼠麻醉后取出胎鼠,無菌條件下分離胎鼠脊髓組織,單細胞克隆技術及干細胞培養(yǎng)技術對分離的細胞進行擴增培養(yǎng),細胞免疫熒光技術對細胞進行鑒定;實驗分為三組:Blank組(無外加條件培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞),GFP組(感染Ad-GFP腺病毒的神經(jīng)干細胞),β-catenin組(感染Ad-β-catenin腺病毒的神經(jīng)干細胞),感染病毒時間均為5d。光學顯微鏡觀察三組細胞的形態(tài)學,熒光顯微鏡觀察病毒的感染效率,流式細胞技術對感染效率進行驗證,Western blot檢測三組細胞β-catenin蛋白的表達情況;CCK8檢測和結晶紫染色法檢測三組細胞的數(shù)量,臺盼藍染色法檢測β-catenin作用于NSCs后細胞的存活率;RT-PCR檢測三組細胞的神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的m RNA表達,免疫熒光檢測神經(jīng)細胞核(Neu N)、GFAP的表達及定位;Western blot檢測Neu N、GFAP的蛋白表達情況。結果胎鼠脊髓組織中分離出的細胞具有極強的克隆能力,可以形成細胞團,機械分離后細胞貼壁,呈不規(guī)則球形,免疫熒光結果提示早期分離的大部分細胞Nestin抗原呈陽性;感染Ad-β-catenin腺病毒5d后,細胞形態(tài)發(fā)生變化,其突觸增長,細胞變小,突觸之間連接增多,細胞折光性增強;熒光顯微鏡觀察及流式細胞技術結果顯示感染病毒3d時細胞的病毒感染率在50%左右,5d時感染率在80%左右,Western blot結果證實感染5d時β-catenin組的β-catenin蛋白表達明顯高于其他兩組(P0.05);CCK8及結晶紫染色結果示β-catenin組的細胞數(shù)量明顯高于Blank組及GFP組(P0.05),臺盼藍染色檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin組的細胞存活率也明顯高于其他兩組(P0.05);PCR結果顯性神經(jīng)細胞標志物NSE的m RNA在β-catenin組顯著高于Blank組及GFP組,而膠質(zhì)細胞標志物GFAP的m RNA表達均低于其他兩組(P0.05);免疫熒光結果顯示β-catenin組Neu N蛋白的表達顯著高于其余兩組(P0.05),主要定位于細胞核中,GFAP的表達相對較低(P0.05);Western blot結果顯示β-catenin組的Neu N蛋白表達顯著高于Blank組及GFP組,而GFAP蛋白表達低于其他兩組(P0.05)。結論胎鼠脊髓組織中分離獲得的細胞可克隆成神經(jīng)球,是具有自我復制及多向分化能力的脊髓源性NSCs;腺病毒可作為載體將β-catenin轉入NSCs中,感染效率高;β-catenin可促進脊髓源性NSCs的增殖,并且提高細胞的存活率,使其向神經(jīng)元分化。
[Abstract]:Objective To study the effect of 尾 - catenin on the expression of 尾 - catenin in rat spinal cord . The expression of 尾 - catenin was detected by Western blot . The results showed that the expression of 尾 - catenin was significantly higher than that in the other two groups ( P0.05 ) . The results showed that the expression of Neu N protein in rat spinal cord tissue was significantly higher than that in the other two groups ( P0.05 ) . The results showed that the expression of Neu N protein was significantly higher than that in the other two groups ( P0.05 ) .

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2

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