本文關鍵詞：GDF-5聯合淫羊藿素誘導BMSCs向類軟骨細胞分化及機制的研究

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【摘要】：目的:研究生長分化因子5(growth differentiation factor-5,GDF-5)聯合淫羊藿素(Icaritin,ICT)誘導SD大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向類軟骨細胞分化,并進一步研究Wnt/β-catenin信號通路在其中的作用。方法:(1)全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),CCK-8法測定細胞生長曲線。(2)取培養(yǎng)至第3代對數生長期的BMSCs進行實驗,根據誘導條件不同分為6組:BMSCs組、BMSCs+ICT組、BMSCs+GDF-5組、BMSCs+GDF-5+ICT組、BMSCs+GDF-5+ICT+SB216763組、BMSCs+GDF-5+ICT+XAV-939組,連續(xù)誘導培養(yǎng)14d后倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。(3)誘導培養(yǎng)14d后,Alcian Blue染色檢測細胞的蛋白聚糖改變。(4)誘導培養(yǎng)14d后,采用RT-PCR檢測成軟骨分化標記基因Aggrecan、COL2、Sox9的表達情況,Western Blot檢測COL2蛋白表達水平。(5)誘導培養(yǎng)14d后,RT-PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件Dvl1、GSK-3β、β-catenin m RNA表達水平,采用Western Blot檢測β-catenin蛋白表達水平。結果:(1)大鼠BMSCs傳至P3代,細胞形態(tài)基本均一,長梭形或扁平狀,呈典型密集旋渦狀、魚群樣排列貼壁生長。(2)BMSCs組連續(xù)培養(yǎng)14d后,細胞排列緊密,并沒有明顯的細胞藍染。BMSCs+ICT組,BMSCs+GDF-5組,BMSCs+GDF-5+ICT組,BMSCs+GDF-5+ICT+SB216763組細胞逐漸縮小,由長梭形逐漸向類圓形轉變,并且蛋白聚糖藍染逐漸加深。但GDF-5+ICT+XAV-939組相對GDF-5+ICT組,細胞形態(tài)改變較少,且染色相對較淺。(3)軟骨細胞標志檢測結果:RT-PCR及Western Blot檢測結果分析表明,與BMSCs組相比,BMSCs+GDF-5組和BMSCs+ICT+GDF-5組軟骨標記基因Aggrecan、Col2、Sox9表達量及Ⅱ型膠原蛋白表達量均明顯增加(P0.05)。與BMSCs+GDF-5組比較,BMSCs+Icaritin+GDF-5聯合組Aggrecan、Col2、Sox9基因表達量及Ⅱ型膠原蛋白表達量也增加(P0.05)。(4)Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件檢測結果:與BMSCs相比,BMSCs+GDF-5組和BMSCs+ICT+GDF-5組Dvl1基因、β-catenin基因及蛋白表達明顯增加,相應的GSK-3βm RNA表達量下降(P0.05);與BMSCs+GDF-5組相比,BMSCs+GDF-5+ICT組Dvl1、β-catenin m RNA表達水平及β-catenin蛋白水平均增加,相應的GSK-3βm RNA表達量下降(P0.05);與BMSCs+ICT+GDF-5組相比,BMSCs+ICT+GDF-5+SB216763組Aggrecan、Sox9和β-catenin m RNA表達量明顯增加,GSK-3βm RNA表達量下降,Ⅱ型膠原蛋白及β-catenin蛋白表達也增加(P0.05),相反BMSCs+ICT+GDF-5+XAV-939組Aggrecan、Col2、Sox9和β-catenin m RNA表達量明顯減少,Ⅱ型膠原蛋白及β-catenin蛋白表達也減少(P0.05),GSK-3βm RNA表達量增加(P0.05)。結論:(1)GDF-5聯合淫羊藿素能夠誘導大鼠BMSCs成軟骨分化,其中ICT起促進作用。(2)Wnt/β-catenin信號通路在GDF-5聯合淫羊藿素誘導大鼠BMSCs成軟骨分化過程中發(fā)揮正向調控作用。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R684

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前4條

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本文編號：1297501