發(fā)布時(shí)間：2017-10-18 01:15

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的MMP-3shRNA轉(zhuǎn)染對人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)

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【摘要】：目的:體外篩選設(shè)計(jì)并合成的抑制效率最佳的MMP-3shRNA慢病毒載體,并觀察其對人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。方法:采用酶序貫消化法對臨床腰椎間盤突出癥患者需行摘除術(shù)來源的髓核組織進(jìn)行分離、單層原代細(xì)胞培養(yǎng),應(yīng)用細(xì)胞免疫組化法、細(xì)胞免疫熒光法等方法對髓核細(xì)胞進(jìn)行鑒定;根據(jù)人MMP-3基因m RNA序列設(shè)計(jì)合成4對不同的MMP-3sh RNA序列,與酶切后LV3載體鏈接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞,通過PCR和基因測序?qū)U(kuò)增的陽性克隆進(jìn)行鑒定,對慢病毒進(jìn)行包裝和滴度測定;通過熒光定量PCR、Western Blot分別檢測轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞后MMP-3、Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因和蛋白質(zhì)水平的變化,從而篩選最佳抑制序列慢病毒載體及其對人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果:原代髓核細(xì)胞呈三角形、多角形或短梭形等不規(guī)則形狀,細(xì)胞核較大,培養(yǎng)約3周時(shí),原代髓核細(xì)胞匯合可達(dá)80%以上;蘇木精-伊紅染色細(xì)胞核呈藍(lán)色,胞漿呈淡紅色,甲苯胺藍(lán)染色胞核成深藍(lán)色,胞漿呈淡藍(lán)色,細(xì)胞免疫組化及細(xì)胞免疫熒光Ⅱ型膠原分別呈黃褐色和綠色熒光。經(jīng)酶切鑒定陽性擴(kuò)增片段正確,基因測序顯示與設(shè)計(jì)序列完全相符,滴度檢測顯示大于1x108TU/ml。MMP3sh RNA慢病毒轉(zhuǎn)染72和96小時(shí)后從MMP-3基因和蛋白水平綜合篩選得出MMP-3sh RNA3為最佳抑制序列(P0.05)。MMP-3sh RNA3轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞5天后檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖m RNA及蛋白水平均增加(P0.01)。結(jié)論:成功構(gòu)建并篩選出抑制效率最佳的MMP-3sh RNA慢病毒載體;慢病毒介導(dǎo)的RNAi可以顯著抑制人退變髓核細(xì)胞MMP-3的表達(dá),從而增加人退變髓核細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)量,有望成為阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的進(jìn)程而治療椎間盤退變。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒 MMP-3 椎間盤退變 RNA干擾 基因治療
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R681.5
【目錄】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第1章 實(shí)驗(yàn)材料9-12
• 1.1 主要試劑9-10
• 1.2 主要儀器10
• 1.3 主要試劑配制10-11
• 1.4 組織來源11-12
• 第2章 實(shí)驗(yàn)方法12-21
• 2.1 人退變髓核細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇及鑒定12-15
• 2.1.1 人退變髓核細(xì)胞的原代單層培養(yǎng)12
• 2.1.2 人退變髓核細(xì)胞的消化傳代12
• 2.1.3 人退變髓核細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇12-13
• 2.1.4 人退變髓核細(xì)胞的鑒定13-15
• 2.2 MMP-3sh RNA慢病毒載體構(gòu)建15-16
• 2.3 MMP-3sh RNA慢病載體在人退變髓核中的篩選16-19
• 2.3.1 慢病毒侵染效率評價(jià)16-17
• 2.3.2 MMP-3sh RNA慢病毒載體的侵染17
• 2.3.3 Real-Time PCR檢測目的基因m RNA水平17-18
• 2.3.4 Real-Time PCR檢測MMP-3 基因不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)18
• 2.3.5 Western-Blot檢測目的蛋白表達(dá)水平18-19
• 2.3.6 Western-Blot檢測MMP-3 蛋白不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平19
• 2.4 最佳干擾片段MMP-3sh RNA慢病毒載體侵染人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)19-20
• 2.4.1 最佳干擾片段MMP-3sh RNA慢病毒載體侵染人退變髓核細(xì)胞19-20
• 2.4.2 Real-Time PCR檢測MMP-3、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)水平20
• 2.4.3 Western-Blot檢測MMP-3、Ⅱ型膠原和蛋白多糖蛋白表達(dá)水平20
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法20-21
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-36
• 3.1 人退變髓核細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果21-24
• 3.1.1 人退變髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察21-22
• 3.1.2 人退變髓核細(xì)胞的鑒定22-24
• 3.2 MMP-3sh RNA載體構(gòu)建及慢病毒包裝結(jié)果24-26
• 3.2.1 PCR鑒定構(gòu)建的慢病毒載體結(jié)果24
• 3.2.2 基因測序結(jié)果24-25
• 3.2.3 病毒滴度測定25-26
• 3.3 MMP-3sh RNA慢病毒載體在人退變髓核細(xì)胞中篩選結(jié)果26-31
• 3.3.1 慢病毒侵染人退變髓核細(xì)胞的效率評價(jià)及MOI計(jì)算26-27
• 3.3.2 重組MMP-3sh RNA慢病毒載體對人退變髓核細(xì)胞的侵染結(jié)果27-28
• 3.3.3 MMP-3sh RNA轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞后MMP-3m RNA表達(dá)抑制水平28-30
• 3.3.4 MMP-3sh RNA轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞后MMP-3 蛋白表達(dá)抑制水平30-31
• 3.4 MMP3-sh RNA3(6076)轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的效應(yīng)31-36
• 3.4.1 MMP-3m RNA和MMP-3 蛋白的干擾效果檢測31-33
• 3.4.2 Real-Time PCR檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖m RNA表達(dá)情況33-34
• 3.4.3 Western Blot檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖蛋白表達(dá)34-36
• 討論36-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 綜述：腰椎間盤退變基因治療研究進(jìn)展45-60
• 綜述參考文獻(xiàn)55-60
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果60-61
• 附錄61-63
• 致謝63-64

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