本文關(guān)鍵詞：微電極陣列系統(tǒng)研制及其在體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究中的初步應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：離體培養(yǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的簡化模型,對于研究神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)、記憶、可塑性、連接性和信息處理等相關(guān)神經(jīng)科學(xué)問題具有重要的價值。微電極陣列是一種集成了數(shù)十或者更多個微采集單元的元件,具有無損傷性、環(huán)境可控性和操作簡便等優(yōu)點,能夠以無損的方式長期、實時的檢測離體神經(jīng)元的電生理活動,為離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)研究提供了一種有力的研究手段。目前,微電極陣列系統(tǒng)已經(jīng)在神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能連接與再生、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)育規(guī)律研究、生理節(jié)律以及神經(jīng)藥理毒理學(xué)等方面有了大量的應(yīng)用,成為神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域的重要工具和手段。 微電極陣列最早出現(xiàn)于1972年,經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展,相關(guān)研究已取得了明顯進(jìn)展。出現(xiàn)了多種不同用途的微電極陣列和系統(tǒng),部分常規(guī)微電極陣列和系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到了較高的水平,并且實現(xiàn)了商業(yè)化,如德國MCS系統(tǒng)等。盡管商業(yè)化系統(tǒng)做工精細(xì)、軟件界面美觀人性化、數(shù)據(jù)處理功能強大而且系統(tǒng)穩(wěn)定,但是存在價格昂貴、易損耗等不足,為相關(guān)研究的大量開展帶來沉重的經(jīng)費負(fù)擔(dān)。此外,商業(yè)化的產(chǎn)品功能相對固定,難以針對具體的研究要求進(jìn)行改造升級,因此常出現(xiàn)無法滿足具體實驗需求的情況�；诖�,國內(nèi)外不少實驗室均在嘗試開發(fā)自己的微電極陣列系統(tǒng),以更好地滿足特定的實驗需求。 在基于微電極陣列的離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究中,首先要在微電極陣列上開展離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建研究,這一過程常面臨著幾個關(guān)鍵問題。如何提升神經(jīng)元在微電極陣列表面粘附與存活是其中的關(guān)鍵問題之一。在微電極陣列的制作過程中,一般會使用二氧化硅、氮化硅或者一些高聚物材料作為電極導(dǎo)線的絕緣材料,這些材料不能保證優(yōu)良絕緣性的同時兼具有良好的生物相容性,而且神經(jīng)元本身的細(xì)胞粘附能力較差,因此對微電極陣列的表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?以改善其生物相容性,促進(jìn)神經(jīng)元的粘附,成為基于微電極陣列進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建亟需解決的首要問題。國際上用于微電極陣列表面涂層修飾的材料有：Matrigel、膠原、多聚賴氨酸、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白和聚乙烯亞胺等。其中,Matrigel來源于天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分,富含多種生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,具有良好的生物相容性和生物活性,是一種非常優(yōu)良的表面涂層修飾材料。在以往的報道中,盡管Matrigel已在微電極陣列表面涂層修飾中得到了應(yīng)用,并取得了良好的結(jié)果,但其中的許多關(guān)鍵問題尚未得到闡明,尤其是在Matrigel濃度對神經(jīng)元粘附與存活影響方面,相關(guān)研究尚未報道。 所選擇的細(xì)胞接種密度是否合適是影響構(gòu)建的離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)質(zhì)量的另一個重要因素。在微電極陣列表面上進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建時,為了更好地促進(jìn)神經(jīng)元的存活和粘附,研究人員通常會以較高密度接種。然而,研究表明,不適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元密度對于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元的長期存活、電活動發(fā)育與質(zhì)量等均具有顯著的影響。神經(jīng)元的接種密度如何影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)電信號質(zhì)量以及獲取高質(zhì)量神經(jīng)電信號的最佳神經(jīng)元接種密度如何目前仍沒有統(tǒng)一的結(jié)論。 基于上述分析,本課題首先進(jìn)行了微電極陣列系統(tǒng)的研制,在此基礎(chǔ)之上開展基于微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與條件優(yōu)化研究,進(jìn)一步利用自研的微電極陣列系統(tǒng)與構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究平臺,初步開展了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電刺激與藥物刺激反應(yīng)特性研究,以驗證本系統(tǒng)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)研究中的適用性和可靠性。本課題的主要研究內(nèi)容分為以下三個部分： 第一部分：微電極陣列的制備及多通道電生理檢測系統(tǒng)的研制。 本部分研究利用印刷電路板開發(fā)技術(shù)進(jìn)行了多通道電生理檢測系統(tǒng)硬件部分的制備,開發(fā)了基于Lab VIEW的數(shù)據(jù)采集軟件系統(tǒng),并使用微加工技術(shù)進(jìn)行了平面微電極陣列、瓊脂糖井型微電極陣列和印章圖形化微電極陣列的制作。 所研制的多通道采集系統(tǒng),輸入噪聲Vrms2μV、帶寬為10～10000Hz、放大倍數(shù)為1000倍、多通道采樣頻率最高可達(dá)20KHz,可以進(jìn)行32通道的數(shù)據(jù)采集、濾波和存儲,總共造價小于3萬人民幣,其造價遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于商業(yè)系統(tǒng)的售價(超過50萬元)。所研制的平面微電極陣列具有較好的電學(xué)特性,可用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究,此外本研究成功研制了瓊脂糖井型微電極陣列和印章圖形化微電極陣列。 第二部分：基于平面微電極陣列的二維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的制備與條件優(yōu)化研究。 本部分研究使用不同濃度的Matrigel鋪板,并將分離培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元接種在微電極陣列上,觀察其對細(xì)胞粘附和活力的影響,摸索最佳的Matrigel鋪板濃度。然后,在最佳Matrigel濃度鋪板下,在微電極陣列的表面按照500個/mm2、1000個/mm2、2000個/mm2、4000個/mm2和8000個/mm25種密度進(jìn)行接種,以期獲得信號質(zhì)量較高的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。 結(jié)果表明,本部分研究成功分離出了皮層神經(jīng)細(xì)胞,免疫熒光結(jié)果表明,7天的皮層培養(yǎng)物中包含MAP2陽性的神經(jīng)元、GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞等。將微電極陣列以不同濃度Matrigel鋪板之后,細(xì)胞的粘附情況不同,低濃度Matrigel鋪板的微電極陣列上細(xì)胞粘附數(shù)量較少,高濃度Matrigel鋪板的微電極陣列上粘附數(shù)量增多,但是容易出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,微電極陣列使用濃度為0.2-0.4mg/mL的Matrigel鋪板后神經(jīng)元粘附的數(shù)量較多且均勻性最好。不同細(xì)胞密度接種的微電極陣列上細(xì)胞培養(yǎng)物的MAP2免疫熒光染色結(jié)果表明,隨著接種密度的增加,MAP2陽性的細(xì)胞數(shù)也會增加,但是相比于2000個/mm2的接種密度而言,8000個/mm2接種密度條件下MAP2陽性的數(shù)量僅增加了不足2倍,細(xì)胞核染色結(jié)果表明不同接種密度構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)培養(yǎng)14天后存活的細(xì)胞密度相似。信號記錄的結(jié)果表明,神經(jīng)培養(yǎng)物培養(yǎng)約1周開始出現(xiàn)電活動,隨著培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的電活動逐漸增加。比較而言,以2000個/mm2細(xì)胞接種密度構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在培養(yǎng)過程中可以檢測到最為頻繁的脈沖和同步簇發(fā)放電活動。 第三部分：基于平面微電極陣列神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電刺激與藥物刺激反應(yīng)特性研究。 在基于微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電刺激反應(yīng)特性研究方面： 本部分研究使用自研的微電極陣列系統(tǒng),分別對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行先正后負(fù)和先負(fù)后正不同強度的電脈沖刺激來確定最佳的電流脈沖刺激條件。然后在細(xì)胞培養(yǎng)第10天、14天、18天、22天時,分別對16個電極進(jìn)行電刺激同時記錄其他電極的響應(yīng)情況,進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)自發(fā)發(fā)育過程中的電刺激-響應(yīng)性特征的研究。 結(jié)果表明,先負(fù)后正強度為10μA的電流刺激(正負(fù)相持續(xù)時間均為400μs)施加在活性電極(有自發(fā)電活動的電極)幾乎可以100%的誘發(fā)出響應(yīng),重復(fù)10次刺激獲得響應(yīng)的結(jié)果排除了響應(yīng)信號為自發(fā)電活動的可能。在細(xì)胞培養(yǎng)第10天、14天、18天、22天時,對16個電極進(jìn)行重復(fù)電刺激后繪制的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)刺激-響應(yīng)性特征圖譜,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的連接數(shù)隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加,培養(yǎng)至22天時大部分的電極之間都存在著刺激-響應(yīng)性。這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道的相關(guān)結(jié)果相一致,表明自研的微電極陣列系統(tǒng)具有可靠性和穩(wěn)定性,并可以聯(lián)合電刺激手段進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)方面的相關(guān)研究。 在基于微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥物刺激反應(yīng)特性研究方面： 本部分研究使用自研的微電極陣列系統(tǒng),考察不同濃度L-谷氨酸鈉和GABA刺激對微電極陣列上神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電活動的影響,來驗證自研系統(tǒng)在藥物評價方面的適用性。 結(jié)果表明,在一定的濃度范圍內(nèi),隨著L-谷氨酸鈉的濃度的增加,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平均脈沖率與平均簇發(fā)放電率均表現(xiàn)為增加的趨勢,達(dá)到平臺期后隨著藥物濃度的增加,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動反而會由于L-谷氨酸鈉的興奮性神經(jīng)毒性而受到一定抑制。γ-氨基丁酸(GABA)為腦內(nèi)的重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),在本研究中,其對神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響與濃度相關(guān),隨著濃度的增加,神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的平均脈沖率、平均簇發(fā)放電率均下降,且在濃度為10μM時,神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的信號被完全抑制。上述藥物評價的結(jié)果符合藥物作用效能,與文獻(xiàn)報道的相關(guān)結(jié)果相一致,表明自研的微電極陣列系統(tǒng)具有可靠性和穩(wěn)定性,可用于基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的藥物評價等相關(guān)研究。
【關(guān)鍵詞】：微電極陣列 離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 電刺激 藥物刺激
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.6
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-20
• 第一部分：微電極陣列的制備及多通道電生理檢測系統(tǒng)的研制20-34
• 材料20-21
• 1.主要設(shè)備儀器20-21
• 2.主要試劑耗材21
• 3.主要溶液21
• 方法21-25
• 1.平面微電極陣列的制備與評價21-22
• 2.瓊脂糖井型微電極陣列的制備與評價22-23
• 3.基于碳納米管和Matrigel的印章圖形化的微電極陣列制備與評價23
• 4.硬件采集系統(tǒng)的設(shè)計與制備23-24
• 5.軟件系統(tǒng)的設(shè)計與開發(fā)24-25
• 結(jié)果25-31
• 1.微電極陣列的制備與評價25-28
• 2.硬件采集系統(tǒng)的制備28-29
• 3.軟件系統(tǒng)的設(shè)計與開發(fā)29-31
• 討論31-34
• 第二部分：基于平面微電極陣列的二維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)制備與條件優(yōu)化研究34-48
• 材料34-35
• 1.主要實驗動物34
• 2.主要設(shè)備儀器34-35
• 3.主要試劑耗材35
• 4.主要溶液35
• 方法35-37
• 1.皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)35-36
• 2.神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光鑒定36
• 3.在微電極陣列上使用不同濃度Matrigel鋪板對大鼠胚胎皮層神經(jīng)細(xì)胞粘附、活力的影響36
• 4.神經(jīng)活動電信號記錄36
• 5.神經(jīng)電生理信號分析36-37
• 6.圖像分析37
• 7.統(tǒng)計分析37
• 結(jié)果37-44
• 討論44-48
• 第三部分：基于平面微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電刺激與藥物刺激反應(yīng)特性研究48-68
• 實驗一：基于平面微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電刺激反應(yīng)特性研究49-57
• 材料49-50
• 1.主要實驗動物49
• 2.主要儀器設(shè)備49
• 3.主要試劑耗材49-50
• 4.主要溶液50
• 方法50-51
• 1.皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)50
• 2.電刺激裝置50
• 3.神經(jīng)電生理信號分析50-51
• 結(jié)果51-55
• 討論55-57
• 實驗二：基于平面微電極陣列的神經(jīng)類藥物評價研究57-68
• 材料57-58
• 1.主要實驗動物57
• 2.主要設(shè)備儀器57-58
• 3.主要試劑耗材58
• 4.主要溶液58
• 方法58-60
• 1.皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)58
• 2.藥物的施加和信號記錄58-59
• 3.神經(jīng)電生理信號分析59
• 4.統(tǒng)計學(xué)分析59-60
• 結(jié)果60-64
• 1.神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)對L-谷氨酸鈉的反應(yīng)60-62
• 2.神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)對γ-氨基丁酸的反應(yīng)62-64
• 討論64-68
• 結(jié)論68-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 中文綜述76-85
• 參考文獻(xiàn)81-85
• 個人簡歷85-87
• 致謝87

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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10 孔敏;高玉興;;抗癲癇藥對大鼠認(rèn)知及海馬GluR2和Syn表達(dá)的影響[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年07期

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  本文關(guān)鍵詞：微電極陣列系統(tǒng)研制及其在體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究中的初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：394290