研究背景金納米顆粒(GNPs)作為一類重要的材料,具有細(xì)胞毒性低、化學(xué)穩(wěn)定性好、易于合成和功能化等優(yōu)點(diǎn)。近年來,金納米顆粒在疾病診斷和治療方面已經(jīng)顯示出巨大的潛力。為特定的應(yīng)用,GNPs通常采用各種生物學(xué)配體進(jìn)行功能化,包括氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和核酸等攜帶氨基的配體。一旦進(jìn)入生物體液,GNPs將被蛋白質(zhì)包裹,所形成的蛋白環(huán)冠會在空間上阻礙配體的靶向性功能。以前的研究通常采用標(biāo)準(zhǔn)離心法或蔗糖墊離心法來制備和分析蛋白環(huán)冠。然而,這些方法均不適用于對配體結(jié)合的蛋白環(huán)冠進(jìn)行特異分析。由此,我們提出一種新鎖定策略對金納米氨基配體所結(jié)合的環(huán)冠復(fù)合物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。方法1.含半胱氨酸配體連接GNPs的合成與表征:取適量的氯金酸溶解在超純水中,按比例先后加入二水檸檬酸鈉和L-半胱氨酸,通過過濾得到含半胱氨酸的GNPs,使用透射電子顯微鏡(TEM)對其進(jìn)行表征分析。2.人血漿樣本的采集:通過靜脈刺穿的方法采集正常志愿者的血液樣品,通過離心分離,得到血漿。3.蛋白環(huán)冠的形成和分離:將半胱氨酸連接的GNPs與血漿在37℃的恒溫箱中震蕩孵育得以充分結(jié)合,之后用三種不同的處理方法進(jìn)行分離得到蛋白環(huán)冠,即常規(guī)方法標(biāo)準(zhǔn)離心法(方法I),蔗糖墊緩沖離心法(方法II),以及我們所提新方法(方法III):先采用甲醛進(jìn)行快速交聯(lián),并對甲醛濃度和交聯(lián)時間進(jìn)行摸索,在最佳交聯(lián)濃度和時間的條件下,經(jīng)過嚴(yán)厲的洗滌將與半胱氨酸結(jié)合的蛋白環(huán)冠與GNPs表面結(jié)合的蛋白環(huán)冠進(jìn)行有效分離,最終得到配體相關(guān)環(huán)冠復(fù)合物。4.定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析:將三種方法所得蛋白質(zhì)溶液煮沸,其中甲醛交聯(lián)的樣品被煮沸20分鐘以破壞蛋白間化學(xué)交聯(lián),采用SDS-PAGE將蛋白質(zhì)樣品濃縮于短膠中,膠內(nèi)酶解后,采用液-質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜檢測(LC-MS/MS)對酶解肽段進(jìn)行檢測,蛋白質(zhì)搜庫后進(jìn)行生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)分析,對三種方法的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行非標(biāo)定量比較。5.蛋白環(huán)冠位點(diǎn)的解析:將未煮沸的甲醛交聯(lián)樣品采用SDS-PAGE進(jìn)行分離,切取條帶并進(jìn)行膠內(nèi)酶解后,進(jìn)行質(zhì)譜檢測。在Mascot搜索中設(shè)置可變修飾,其中將半胱氨酸標(biāo)記作為可變修飾以便進(jìn)行位點(diǎn)解析。結(jié)果1.TEM結(jié)果顯示,所合成的半胱氨酸連接金納米顆粒大小均一,約為17nm。2.GNPs與人血漿形成蛋白環(huán)冠后,使用甲醛快速交聯(lián),通過濃度和時間摸索,我們發(fā)現(xiàn)甲醛快速交聯(lián)所需濃度為7.5%,所用交聯(lián)時間為5秒。3.通過質(zhì)譜檢測,方法I,II和III所得蛋白環(huán)冠中,分別有295±12,298±20和217±5個蛋白質(zhì)被鑒定�？傮w而言,三種方法的所有蛋白質(zhì)顯示出相似的MW,pI和GRAVY分布圖。相比于方法I和II,方法III中環(huán)冠蛋白質(zhì)具有不同的理化性質(zhì)和獨(dú)特的生理分子功能,表明該方法所得蛋白環(huán)冠是半胱氨酸配體結(jié)合的特有成分。4.在位點(diǎn)解析中,共有456個蛋白質(zhì)被鑒定,經(jīng)STRING分析產(chǎn)生302個相互作用的蛋白和8572個相互作用的位點(diǎn),表明半胱氨酸配體結(jié)合的環(huán)冠是一個較為龐大的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。另外,通過質(zhì)譜檢測,我們還發(fā)現(xiàn)有11個蛋白質(zhì)直接與半胱氨酸存在相互作用,為解析環(huán)冠如何阻擋配體功能提供了重要的直接證據(jù)。結(jié)論本研究所建立的新方法能有效捕捉到半胱氨酸配體結(jié)合的蛋白環(huán)冠復(fù)合物,聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為GNPs中氨基類配體所結(jié)合的蛋白環(huán)冠分析提供了一種通用策略,也為解析環(huán)冠如何掩蔽配體功能提供了方法學(xué)工具和直接證據(jù)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

14圖 1. 三種不同方法制備蛋白環(huán)冠的流程圖。Figure 1. Flow chart of the three different methods for proteomic analysis of the goldnanoparticle (GNP) corona.1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白質(zhì)樣品與 2×凝膠上樣緩沖液混合，方法 I 和方法 II 的樣品在 95℃條件下加熱 5min，方法 III 所得樣品加熱 20min 以逆轉(zhuǎn)甲醛交聯(lián)[41]。每個蛋白樣品取 10μg 在由 3 層組成的垂直聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳[47]，凝膠包括 4%堆積膠，長約 1cm 的 10%分離膠和 50%阻隔膠。電泳條件為：恒壓 80V，20 min，120 V，1 h。電泳完成后，取下凝膠，固定液固定 1 小時，棄去固定液，ddH2O

圖 2. 在半胱氨酸附著的金納米顆粒（GNPs）和環(huán)冠蛋白之間的甲醛交聯(lián)反應(yīng)方案和相應(yīng)的用于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)鑒定的可變修飾。Figure2. Reaction scheme (A or B) of formaldehyde crosslinking between cysteine-attachedgold nanoparticles (GNPs) and corona proteins and the corresponding variable modificationfor mass spectrometry (MS)-based protein identification.1.3.11 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析利用 PI/MS 工具計(jì)算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量，使用 ProtParam 工具程序估計(jì)蛋白質(zhì)的 GRAVY[50]。蛋白質(zhì)生理功能的劃分根據(jù) UniProt 的注釋和 IntegratedDiscovery 6.7 生物信息學(xué)工具[51]。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)由 STRING 工具檢索，檢索參數(shù)設(shè)置為中等置信度（STRING score= 0.4）[52]。使用 Cytoscape-PluginMCODE 軟件對網(wǎng)絡(luò)中幾個高度連接的區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步分析[41,53]。對于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，使用 SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行事后最小顯著性差異檢驗(yàn)，P 值小于 0.05 被認(rèn)為具有顯著差異[49]。

3. 半胱氨酸附著金納米顆粒的透射電子顯微鏡（TEM）圖像和尺寸分布直方圖。e 3. Transmission electron microscopy (TEM) image and size distribution histogramcysteine-attached gold nanoparticles (GNPs) used in the present study.甲醛快速交聯(lián)的最佳條件交聯(lián)時間一定，甲醛交聯(lián)的濃度為 7.5%及以上濃度時，蛋白條帶沒有，表明 7.5％足以固定 GNP-蛋白質(zhì)相互作用（圖 4A）。當(dāng)甲醛交聯(lián)濃度時，可觀察到在使用較長反應(yīng)時間獲得的蛋白條帶沒有明顯差異，表明時間足夠（圖 4B）。因此，快速固定半胱氨酸結(jié)合蛋白環(huán)冠的最佳交聯(lián)7.5％，交聯(lián)時間為 5s。
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本文編號：2836116