發(fā)布時間：2020-09-02 12:20

　　 在過去的20年內(nèi),熒光標記技術(shù)與雙光子顯微技術(shù)的發(fā)展為神經(jīng)科學的研究提供了重要的研究工具,使在體跟蹤與操縱神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和微脈管系統(tǒng)成為可能,從而更有效地理解大腦。然而皮層上方顱骨的混濁特性嚴重制約了光學成像對皮層結(jié)構(gòu)與功能的觀察。為此,研究人員通過將顱骨完全或者部分去除的方式,建立了多種顱窗,但都存在一定的弊端與不足。組織光透明通過降低組織的散射,為克服渾濁顱骨對光學成像的制約提供了全新的思路。但現(xiàn)有研究多局限于離體組織與器官,針對活體組織的光透明研究較少。本文的工作正是圍繞活體顱骨光透明而展開的,旨在建立高效、安全、操作簡便的光透明顱窗,實現(xiàn)細胞、亞細胞分辨水平的穿顱活體皮層成像。本文的主要內(nèi)容如下:(1)顱骨光透明試劑的選型與方法的構(gòu)建:基于顱骨特殊的分層結(jié)構(gòu)及組分,以簡便、高效、快速為原則,通過離體和在體實驗對顱骨光透明試劑進行選型,最終確定顱骨光透明試劑由膠原蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉和甘油組成;針對不同年齡的小鼠,確立適用于活體皮層成像的光透明顱窗的實施方案。(2)光透明顱窗實施活體皮層成像的性能評估:開展活體皮層成像實驗,從有效性、重復性、與熒光蛋白/染料的兼容性等方面對光透明顱窗的性能評估。結(jié)果顯示,實施顱骨光透明處理后,光學成像的信噪比、分辨率與成像深度得以極大地提高,獲取了亞細胞分辨水平的皮層結(jié)構(gòu)信息,實現(xiàn)了皮層250μm深度內(nèi)神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和血管的高分辨重復成像。(3)光透明顱窗的安全性評估:光透明顱窗結(jié)合多種光學成像技術(shù),觀測皮層免疫細胞的短期與長期響應(yīng)、皮層星形膠質(zhì)細胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達、以及皮層血流分布或血管重構(gòu)與再生,評估光透明顱窗的安全性。結(jié)果顯示該顱窗既未激活皮層的小膠質(zhì)細胞,也未引起皮層膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的上調(diào);既未改變皮層血流分布,也未引起軟膜血管重構(gòu)與再生,從而證明該顱窗的安全性。(4)光透明顱窗的初步應(yīng)用:(1)激光損傷后皮層樹突和小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化的動態(tài)觀測;(2)腦梗塞后皮層樹突和小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化的動態(tài)觀測;(3)發(fā)育關(guān)鍵期皮層突觸可塑性的動態(tài)觀測。結(jié)果顯示,激光損傷后,損傷區(qū)域樹突形成串珠狀結(jié)構(gòu),而損傷區(qū)域小膠質(zhì)細胞的突起朝向損傷部位運動,這與文獻結(jié)果一致;腦梗塞后,梗塞區(qū)域樹突迅速形成串珠狀結(jié)構(gòu),這與文獻結(jié)果一致。梗塞區(qū)域小膠質(zhì)細胞并沒有迅速被激活,在梗塞后的24小時其形態(tài)和分布均發(fā)生劇烈變化,從而證實小膠質(zhì)細胞的浸潤時間窗為0 24小時之間;通過對第三周小鼠皮層突觸可塑性的動態(tài)觀測,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵期小鼠皮層樹突棘和絲狀偽足的能動性很高,其桶狀皮層樹突棘在1小時內(nèi)的新生率和消亡率分別為3.20±0.36%和1.83±0.91%,并觀察到絲狀偽足轉(zhuǎn)變成樹突棘結(jié)構(gòu),這暗示了絲狀偽足可能是樹突棘的前體。綜上所述,本文構(gòu)建了一種適用于活體皮層成像的光透明顱窗,通過在顱骨表面涂抹光透明試劑來減小顱骨的散射,形成一個可觀測皮層的視窗。與雙光子成像相結(jié)合,實現(xiàn)對皮層神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和血管的高分辨活體成像研究。此顱窗具有高效、安全、可重復且操作簡便等特點,既能實現(xiàn)對皮層細胞、亞細胞水平結(jié)構(gòu)的跟蹤觀察,也可實現(xiàn)對皮層特定區(qū)域的靶向操縱。這種光透明顱窗有望為生理或疾病狀態(tài)下皮層神經(jīng)、血管的結(jié)構(gòu)與功能性成像研究提供重要工具。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R318
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文樣本，雙光子使用的是平均功率很低的脈沖光。將脈沖激光與高數(shù)值孔徑的物鏡結(jié)合增大了光子密度，進而增加了雙光子同時被熒光團吸收的可能性。雙光子是非線性激發(fā)的過程，熒光團的吸收率與激發(fā)光功率的平方根成線性，對于聚焦的激光而言，只有焦平面的光子密度最高，在焦平面的上下光強隨著距離的平方衰減，因此只有在接近衍射限制體積內(nèi)的熒光團被激發(fā)[7,28,33]。與單光子成像相比，雙光子局部激發(fā)不需要在探測器前加共焦針孔，具有三大優(yōu)勢：光漂白光毒性更小、成像深度更深、對比度更高。因此更適合于活體高分辨成像研究。

圖 1.2 雙光子活體成像的典型應(yīng)用。（a）神經(jīng)可塑性研究[12]；（b）小膠質(zhì)細胞的結(jié)構(gòu)與功能研究[52]；（c）毛細血管流速的研究[36]；（d）雙光子活體鈣成像的研究[58]；（e）光解籠鎖的研究[60]（f）光遺傳技術(shù)的研究[64]。Figure 1.2 The typical applications of two-photon imaging. (a) The neural plasticity[12]. (b) Thestructure and function of microglia[52]. (c) The velocity of blood flow[36]. (d) Calcium imaging[58]. (e)Photolysis[60]. (f) Optical genetic technology[64].下面以結(jié)構(gòu)成像中突觸連接的發(fā)育與可塑性研究為例，對其進行較為詳細的介紹：在整個生命過程中都有突觸的形成和消失，相關(guān)小組研究了在不同的發(fā)育階段樹突棘可塑性變化規(guī)律，研究結(jié)果表明樹突棘的穩(wěn)定性隨年齡的增長而逐漸形成，新生小鼠出生后約兩周內(nèi)樹突棘新生率大于消亡率，樹突棘的數(shù)目逐漸增加，兩周達到最大，這屬于樹突棘的發(fā)生過程，樹突棘在發(fā)育階段可塑性很高，在小鼠達到成年前樹突棘消亡率逐漸高于生成率，樹突棘總量明顯下降，表現(xiàn)出樹突棘的修剪在不同的腦區(qū)樹突棘修剪發(fā)生的幅度和時程不同，到了成年趨于穩(wěn)定，為信息的長

圖 1.3 實施活體皮層成像的顱窗技術(shù)。（a）磨薄顱窗[12]；（b）開顱玻璃窗[11]；（c）基于磨薄手術(shù)的磨薄加固的顱窗[81]；（d）基于開顱手術(shù)并用生物相容的硅樹脂替代玻片的顱窗[76]；（e）基于開顱手術(shù)和微型光學流體裝置的顱窗[71]。Figure 1.3 Schematic view of current crainal windows for in vivo imaging. (a) The thinned-skullwindow[12]. (b) The open-skull glass window[11]. (c) The polished and reforced thinned skull window(PORTs)[81]. (d) The cranial window based on the craniotomy by using biocompatible silicone insteadof cover slide[76]. (e) The cranial window based on craniotomy and micro-optical fluid devices[71].1.2.3 其它顱窗2010 年研究人員發(fā)展了磨薄加固的顱窗技術(shù)（PORTs）[64,81,82]，它是通過將磨削手術(shù)和開顱手術(shù)兩種技術(shù)結(jié)合在一起而實現(xiàn)的，首先將顱骨打磨至極�。�10 1μm），再在剩余的骨膜上覆蓋玻片，這種方式結(jié)合了磨削手術(shù)和開顱手術(shù)這兩種技術(shù)的特點，通過將顱骨磨薄而不是開顱，避免了由暴露硬腦膜引起的炎癥反應(yīng)和皮層損傷，同時用玻片覆蓋剩余的骨組織可有效地阻止骨再生，因此在重復成像之前無需再次對同一位點進行反復磨削，實現(xiàn)了手術(shù)后無需在有其他干預的情況下在任

【參考文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 張洋;顱骨光透明實現(xiàn)穿顱皮層血管與血流成像[D];華中科技大學;2014年

本文編號：2810587