發(fā)布時(shí)間：2020-08-15 18:52

【摘要】：隨著人類生產(chǎn)、生活節(jié)奏的加快,人口老齡化的加劇,骨和軟骨損傷的患者呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。導(dǎo)致骨和軟骨損傷的原因有很多,其中主要包括:意外事故、生產(chǎn)生活、骨腫瘤、先天性疾病、年齡增長(zhǎng)等因素。在這些骨損傷的疾病中,如何治療臨界尺寸骨缺損是臨床上面臨的一個(gè)難題,這類骨損傷疾病很難愈合,很容易造成骨不連等后遺癥。目前,臨床上主要有自體骨移植、異體骨移植等治療方法。自體骨取材來(lái)源于患者本身,雖然無(wú)免疫排斥反應(yīng),骨誘導(dǎo)能力強(qiáng),但是來(lái)源有限,患者還要經(jīng)歷取骨的二次手術(shù)帶來(lái)的痛苦。異體骨來(lái)源充足,可以滿足臨床上治療骨缺損的大量需求,但是自體骨存在免疫排斥反應(yīng)和病毒感染等風(fēng)險(xiǎn),因此也不是骨缺損修復(fù)的最佳解決方法。為了解決上述的問(wèn)題,使用骨組織工程技術(shù)制備骨缺損替代物的研究工作成為了該領(lǐng)域的研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。作為骨損傷替代物應(yīng)該具備以下的特點(diǎn):(1)多孔結(jié)構(gòu)為成骨細(xì)胞的粘附和增殖提供空間和場(chǎng)所,(2)具體一定的機(jī)械性能和力學(xué)強(qiáng)度,(3)替代物的材料應(yīng)該具有良好的生物相容性和體內(nèi)可吸收性,(4)具有良好的骨誘導(dǎo)能力,促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。因此一個(gè)優(yōu)良的臨界大尺寸骨缺損替代物應(yīng)該具備以上這些特性。在軟骨損傷方面,本研究主要關(guān)注由軟骨細(xì)胞衰老、凋亡、分化等因素導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)。小分子RNA(Micro RNAs,miRNAs)作為一類內(nèi)源性非編碼RNA,在體內(nèi)可以調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),從而影響這細(xì)胞的功能。miRNAs能夠和mRNA的特異性的相互作用,促進(jìn)mRNA的降解并抑制mRNA的翻譯,影響著相應(yīng)的基因發(fā)揮作用。很多研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在OA患者的軟骨細(xì)胞中,伴隨著多個(gè)miRNAs的上調(diào)和下調(diào)表達(dá),這說(shuō)明miRNAs能夠參與OA的形成和病情的加劇。本研究擬從miR-495為切入點(diǎn),從信號(hào)通路角度研究miR-495與OA形成的機(jī)制和關(guān)系,從而尋找一個(gè)治療OA的新靶點(diǎn)�；谝陨系乃悸�,本研究的具體方案如下:(1)使用旋蝶紡絲技術(shù),制備具有微納米直徑的骨缺損修復(fù)支架,這種技術(shù)制備的纖維支架與傳統(tǒng)的電紡絲技術(shù)制備的纖維相比,孔隙率較高,同時(shí)具有很好的立體結(jié)構(gòu)。制備纖維的材料選用的是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA),PLGA這種材料具有良好的生物學(xué)活性和體內(nèi)可降解性,HA具有良好的骨誘導(dǎo)能力和體內(nèi)礦化作用。從材料和制備工藝角度分析,本研究中使用的PLGA和HA能夠充分滿足作為骨修復(fù)替代物的要求。為了進(jìn)一步改善材料表面的親水性和細(xì)胞粘附、增殖能力,利用多巴胺分子在堿性條件下聚合形成聚多巴胺(polydopamine,PDA)的性質(zhì)在纖維支架表面形成一層PDA,利用PDA的粘附能力在纖維支架上粘附骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)生長(zhǎng)因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLGA纖維支架在經(jīng)過(guò)PDA修飾后,表面的親水能力得到了顯著的提升,BMP-2的固定能力也得到了明顯的增高,經(jīng)過(guò)28天緩釋的檢測(cè),經(jīng)過(guò)PDA固定后的BMP-2呈現(xiàn)出緩慢釋放的特性。以上這些結(jié)果說(shuō)明我們成功的制備了一種能夠緩慢釋放BMP-2、親水性好、高孔隙的骨修復(fù)支架。(2)使用MC3T3-E1細(xì)胞對(duì)支架進(jìn)行細(xì)胞粘附、增殖和成骨誘導(dǎo)能力進(jìn)行評(píng)估。PLGA組的細(xì)胞增殖率是最低的,而PLGA/HA組的細(xì)胞增殖率就明顯的有所提高。這主要是由于HA能夠提高材料表面的親水性、增加表面的粗糙度,這些因素都有利于細(xì)胞的粘附和增殖。當(dāng)材料表面粘附有PDA后,細(xì)胞的增殖率比未涂有PDA的組有所增加。細(xì)胞增殖率最高組發(fā)生在PDA-PLGA/HA/BMP-2。在成骨基因表達(dá)方面,PLGA/HA和PDA-PLGA/HA的RUNX2基因表達(dá)量比PLGA組提升了26%和61%。PDA-PLGA/HA/BMP-2的RUNX2基因表達(dá)量是PDA-PLGA/HA的1.25倍。以上結(jié)果說(shuō)明,HA和BMP-2的引入均能夠有效促進(jìn)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的表達(dá)。OPN基因在PLGA中表達(dá)最低,PDA-PLGA/HA中OPN的表達(dá)量是PLGA組中OPN的表達(dá)量的4倍,PDA-PLGA/HA/BMP-2中OPN的表達(dá)量最高。(3)評(píng)估了miR-495的高表達(dá)或下調(diào)對(duì)體外軟骨細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)和創(chuàng)傷修復(fù)的影響。結(jié)果顯示miR-495的高表達(dá)可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。miR-495的轉(zhuǎn)染明顯阻礙了劃痕創(chuàng)面的修復(fù),導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的損傷修復(fù)能力降低。此外,我們還觀察到miR-495的轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)caspase-3的活化,并進(jìn)一步促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡。miR-495可以直接下調(diào)軟骨細(xì)胞AKT1的表達(dá),而miR-495抑制劑可有效增強(qiáng)AKT1的表達(dá)。因此,miR-495可能通過(guò)靶向AKT1誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡,AKT1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-495轉(zhuǎn)染對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)和創(chuàng)傷修復(fù)的影響。此部分研究工作為治療由于軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的OA疾病提供了一個(gè)藥物的新靶點(diǎn)。本課題研究利用旋蝶紡絲制備方法和PDA固定BMP-2技術(shù)制備了一種骨缺損修復(fù)支架,這種支架可以應(yīng)用于臨界尺寸骨缺損修復(fù)。同時(shí),深入的研究了miR-495在軟骨細(xì)胞凋亡、衰老等方面的作用,發(fā)現(xiàn)了miR-495誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R318.08;R681
【圖文】：

圖 1.1 燒結(jié)法制備的 PLGA 骨修復(fù)支架[1]re1.1 PLGA bone repair scaffold prepared by sintering m子材料支架的生物學(xué)活性和生物相容性的高分子材料可以制備成骨修括天然高分子材料（膠原、纖維蛋白、海藻酸鈉、蠶絲、），這些材料具有良好的加工性、化學(xué)組分穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)子材料如聚乳酸（Polyacticacid, PLA）、聚乙醇酸（Polygiy但是聚合物支架最大的問(wèn)題是在體內(nèi)力學(xué)強(qiáng)度隨著材料的，一些材料降解后還會(huì)產(chǎn)生局部酸性環(huán)境。材料支架支架指的是含有 2 種以上不同來(lái)源材料組成的支架，例如料組成的復(fù)合支架，這種支架既有生物陶瓷所帶來(lái)的骨誘

圖 1.2 3D 打印技術(shù)制備 TCPs/PCL 復(fù)合骨修復(fù)支架[2]igure1.2TCPs/PCLcompositebonerepairscaffoldwaspreparedby3Dprintingtechno（4）金屬支架金屬支架具有無(wú)以倫比的高機(jī)械強(qiáng)度和抗疲勞性能。在金屬材料里面鈦(Tita屬和鉭金屬作為骨修復(fù)材料占據(jù)了絕對(duì)的統(tǒng)治地位。運(yùn)用激光網(wǎng)格成形法制復(fù)支架孔隙率達(dá)到了 17-58%，孔隙平均直徑在 800μm 左右，能夠非常有利于的長(zhǎng)入和粘附[3]。但是金屬材料和生物陶瓷材料、高分子材料相比不能夠攜帶因子，也不能在體內(nèi)降解，同時(shí)會(huì)有一些金屬離子會(huì)釋放。為了進(jìn)一步提高生物活性，一些表面修飾技術(shù)也被應(yīng)用與 Ti 金屬支架材料表面。通過(guò)陽(yáng)極氧在 Ti 金屬表面形成一個(gè) TiO2涂層，TiO2涂層是直徑為 50nm 的管狀結(jié)構(gòu)，這夠增強(qiáng)在體內(nèi)的鈣沉積和礦化，因此會(huì)縮短骨缺損部位的愈合時(shí)間（圖 1.3）

圖 1.2 3D 打印技術(shù)制備 TCPs/PCL 復(fù)合骨修復(fù)支架[2]Figure1.2TCPs/PCLcompositebonerepairscaffoldwaspreparedby3Dprintingtech（4）金屬支架金屬支架具有無(wú)以倫比的高機(jī)械強(qiáng)度和抗疲勞性能。在金屬材料里面鈦(TTi)金屬和鉭金屬作為骨修復(fù)材料占據(jù)了絕對(duì)的統(tǒng)治地位。運(yùn)用激光網(wǎng)格成形法骨修復(fù)支架孔隙率達(dá)到了 17-58%，孔隙平均直徑在 800μm 左右，能夠非常有利細(xì)胞的長(zhǎng)入和粘附[3]。但是金屬材料和生物陶瓷材料、高分子材料相比不能夠攜活性因子，也不能在體內(nèi)降解，同時(shí)會(huì)有一些金屬離子會(huì)釋放。為了進(jìn)一步提材料生物活性，一些表面修飾技術(shù)也被應(yīng)用與 Ti 金屬支架材料表面。通過(guò)陽(yáng)極程。在 Ti 金屬表面形成一個(gè) TiO2涂層，TiO2涂層是直徑為 50nm 的管狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)能夠增強(qiáng)在體內(nèi)的鈣沉積和礦化，因此會(huì)縮短骨缺損部位的愈合時(shí)間（圖 1.

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