【摘要】：隨著人類生產(chǎn)、生活節(jié)奏的加快,人口老齡化的加劇,骨和軟骨損傷的患者呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。導致骨和軟骨損傷的原因有很多,其中主要包括:意外事故、生產(chǎn)生活、骨腫瘤、先天性疾病、年齡增長等因素。在這些骨損傷的疾病中,如何治療臨界尺寸骨缺損是臨床上面臨的一個難題,這類骨損傷疾病很難愈合,很容易造成骨不連等后遺癥。目前,臨床上主要有自體骨移植、異體骨移植等治療方法。自體骨取材來源于患者本身,雖然無免疫排斥反應,骨誘導能力強,但是來源有限,患者還要經(jīng)歷取骨的二次手術帶來的痛苦。異體骨來源充足,可以滿足臨床上治療骨缺損的大量需求,但是自體骨存在免疫排斥反應和病毒感染等風險,因此也不是骨缺損修復的最佳解決方法。為了解決上述的問題,使用骨組織工程技術制備骨缺損替代物的研究工作成為了該領域的研究的熱點問題。作為骨損傷替代物應該具備以下的特點:(1)多孔結構為成骨細胞的粘附和增殖提供空間和場所,(2)具體一定的機械性能和力學強度,(3)替代物的材料應該具有良好的生物相容性和體內(nèi)可吸收性,(4)具有良好的骨誘導能力,促進細胞向成骨細胞的分化。因此一個優(yōu)良的臨界大尺寸骨缺損替代物應該具備以上這些特性。在軟骨損傷方面,本研究主要關注由軟骨細胞衰老、凋亡、分化等因素導致的骨關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)。小分子RNA(Micro RNAs,miRNAs)作為一類內(nèi)源性非編碼RNA,在體內(nèi)可以調(diào)控多個基因的表達,從而影響這細胞的功能。miRNAs能夠和mRNA的特異性的相互作用,促進mRNA的降解并抑制mRNA的翻譯,影響著相應的基因發(fā)揮作用。很多研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在OA患者的軟骨細胞中,伴隨著多個miRNAs的上調(diào)和下調(diào)表達,這說明miRNAs能夠參與OA的形成和病情的加劇。本研究擬從miR-495為切入點,從信號通路角度研究miR-495與OA形成的機制和關系,從而尋找一個治療OA的新靶點�；谝陨系乃悸�,本研究的具體方案如下:(1)使用旋蝶紡絲技術,制備具有微納米直徑的骨缺損修復支架,這種技術制備的纖維支架與傳統(tǒng)的電紡絲技術制備的纖維相比,孔隙率較高,同時具有很好的立體結構。制備纖維的材料選用的是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA),PLGA這種材料具有良好的生物學活性和體內(nèi)可降解性,HA具有良好的骨誘導能力和體內(nèi)礦化作用。從材料和制備工藝角度分析,本研究中使用的PLGA和HA能夠充分滿足作為骨修復替代物的要求。為了進一步改善材料表面的親水性和細胞粘附、增殖能力,利用多巴胺分子在堿性條件下聚合形成聚多巴胺(polydopamine,PDA)的性質(zhì)在纖維支架表面形成一層PDA,利用PDA的粘附能力在纖維支架上粘附骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)生長因子。實驗結果表明PLGA纖維支架在經(jīng)過PDA修飾后,表面的親水能力得到了顯著的提升,BMP-2的固定能力也得到了明顯的增高,經(jīng)過28天緩釋的檢測,經(jīng)過PDA固定后的BMP-2呈現(xiàn)出緩慢釋放的特性。以上這些結果說明我們成功的制備了一種能夠緩慢釋放BMP-2、親水性好、高孔隙的骨修復支架。(2)使用MC3T3-E1細胞對支架進行細胞粘附、增殖和成骨誘導能力進行評估。PLGA組的細胞增殖率是最低的,而PLGA/HA組的細胞增殖率就明顯的有所提高。這主要是由于HA能夠提高材料表面的親水性、增加表面的粗糙度,這些因素都有利于細胞的粘附和增殖。當材料表面粘附有PDA后,細胞的增殖率比未涂有PDA的組有所增加。細胞增殖率最高組發(fā)生在PDA-PLGA/HA/BMP-2。在成骨基因表達方面,PLGA/HA和PDA-PLGA/HA的RUNX2基因表達量比PLGA組提升了26%和61%。PDA-PLGA/HA/BMP-2的RUNX2基因表達量是PDA-PLGA/HA的1.25倍。以上結果說明,HA和BMP-2的引入均能夠有效促進成骨相關轉錄因子RUNX2的表達。OPN基因在PLGA中表達最低,PDA-PLGA/HA中OPN的表達量是PLGA組中OPN的表達量的4倍,PDA-PLGA/HA/BMP-2中OPN的表達量最高。(3)評估了miR-495的高表達或下調(diào)對體外軟骨細胞凋亡、生長和創(chuàng)傷修復的影響。結果顯示miR-495的高表達可顯著促進軟骨細胞凋亡并抑制其增殖。miR-495的轉染明顯阻礙了劃痕創(chuàng)面的修復,導致軟骨細胞的損傷修復能力降低。此外,我們還觀察到miR-495的轉染能夠促進caspase-3的活化,并進一步促進軟骨細胞的凋亡。miR-495可以直接下調(diào)軟骨細胞AKT1的表達,而miR-495抑制劑可有效增強AKT1的表達。因此,miR-495可能通過靶向AKT1誘導軟骨細胞凋亡,AKT1過表達逆轉了miR-495轉染對軟骨細胞凋亡、生長和創(chuàng)傷修復的影響。此部分研究工作為治療由于軟骨細胞凋亡導致的OA疾病提供了一個藥物的新靶點。本課題研究利用旋蝶紡絲制備方法和PDA固定BMP-2技術制備了一種骨缺損修復支架,這種支架可以應用于臨界尺寸骨缺損修復。同時,深入的研究了miR-495在軟骨細胞凋亡、衰老等方面的作用,發(fā)現(xiàn)了miR-495誘導軟骨細胞凋亡的分子機制。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08;R681
【圖文】：

圖 1.1 燒結法制備的 PLGA 骨修復支架[1]re1.1 PLGA bone repair scaffold prepared by sintering m子材料支架的生物學活性和生物相容性的高分子材料可以制備成骨修括天然高分子材料（膠原、纖維蛋白、海藻酸鈉、蠶絲、），這些材料具有良好的加工性、化學組分穩(wěn)定性等優(yōu)點子材料如聚乳酸（Polyacticacid, PLA）、聚乙醇酸（Polygiy但是聚合物支架最大的問題是在體內(nèi)力學強度隨著材料的，一些材料降解后還會產(chǎn)生局部酸性環(huán)境。材料支架支架指的是含有 2 種以上不同來源材料組成的支架，例如料組成的復合支架，這種支架既有生物陶瓷所帶來的骨誘

圖 1.2 3D 打印技術制備 TCPs/PCL 復合骨修復支架[2]igure1.2TCPs/PCLcompositebonerepairscaffoldwaspreparedby3Dprintingtechno（4）金屬支架金屬支架具有無以倫比的高機械強度和抗疲勞性能。在金屬材料里面鈦(Tita屬和鉭金屬作為骨修復材料占據(jù)了絕對的統(tǒng)治地位。運用激光網(wǎng)格成形法制復支架孔隙率達到了 17-58%，孔隙平均直徑在 800μm 左右，能夠非常有利于的長入和粘附[3]。但是金屬材料和生物陶瓷材料、高分子材料相比不能夠攜帶因子，也不能在體內(nèi)降解，同時會有一些金屬離子會釋放。為了進一步提高生物活性，一些表面修飾技術也被應用與 Ti 金屬支架材料表面。通過陽極氧在 Ti 金屬表面形成一個 TiO2涂層，TiO2涂層是直徑為 50nm 的管狀結構，這夠增強在體內(nèi)的鈣沉積和礦化，因此會縮短骨缺損部位的愈合時間（圖 1.3）

圖 1.2 3D 打印技術制備 TCPs/PCL 復合骨修復支架[2]Figure1.2TCPs/PCLcompositebonerepairscaffoldwaspreparedby3Dprintingtech（4）金屬支架金屬支架具有無以倫比的高機械強度和抗疲勞性能。在金屬材料里面鈦(TTi)金屬和鉭金屬作為骨修復材料占據(jù)了絕對的統(tǒng)治地位。運用激光網(wǎng)格成形法骨修復支架孔隙率達到了 17-58%，孔隙平均直徑在 800μm 左右，能夠非常有利細胞的長入和粘附[3]。但是金屬材料和生物陶瓷材料、高分子材料相比不能夠攜活性因子，也不能在體內(nèi)降解，同時會有一些金屬離子會釋放。為了進一步提材料生物活性，一些表面修飾技術也被應用與 Ti 金屬支架材料表面。通過陽極程。在 Ti 金屬表面形成一個 TiO2涂層，TiO2涂層是直徑為 50nm 的管狀結構，構能夠增強在體內(nèi)的鈣沉積和礦化，因此會縮短骨缺損部位的愈合時間（圖 1.

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