發(fā)布時(shí)間：2020-08-15 14:22

【摘要】：背景介入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄及支架內(nèi)血栓形成是血管介入領(lǐng)域所面臨的巨大挑戰(zhàn),目前新一代藥物支架血栓發(fā)生率已降至0.2%,但再狹窄率仍未得到有效控制,嚴(yán)重影響介入術(shù)后患者的生存質(zhì)量和遠(yuǎn)期預(yù)后,如何把支架內(nèi)再狹窄和血栓形成風(fēng)險(xiǎn)降至最低始終是國(guó)內(nèi)外介入器械研發(fā)的焦點(diǎn)與前沿領(lǐng)域。導(dǎo)師王顯教授基于心脈病證絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)病機(jī)理論,創(chuàng)新中藥單體給藥途徑,將紅豆杉、水蛭的單體成分紫杉醇、水蛭素組成絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)方涂載于冠脈支架表面,制備出新型絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)涂層支架用于心血管急癥的中西醫(yī)結(jié)合介入治療。目前絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物已拓展應(yīng)用于藥物球囊和可降解支架的研發(fā),并在小型豬實(shí)驗(yàn)中初步證實(shí)其安全性及有效性,尤其在防治管腔再狹窄和血栓形成方面所凸顯的優(yōu)勢(shì)更是令人振奮,但其微觀生物學(xué)機(jī)制仍需深入探索。本團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn),絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)證患者體內(nèi)處于高炎癥狀態(tài),現(xiàn)代研究亦表明冠脈介入術(shù)后炎癥微環(huán)境與支架內(nèi)再狹窄和血栓形成密切相關(guān),炎性活化的平滑肌細(xì)胞增殖遷移是再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而抗炎在介入術(shù)后再狹窄的治療中具備有效性,這給我們提供了啟示,絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)病機(jī)理論指導(dǎo)下的絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物防治PCI術(shù)后再狹窄的效應(yīng)機(jī)制可能與其對(duì)炎癥微環(huán)境下血管平滑肌細(xì)胞的調(diào)控作用有關(guān)。進(jìn)而我們從炎癥角度切入,將目光鎖定于經(jīng)典的TLR4-MyD88炎癥通路,以人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HCASMC)作為研究載體,探究絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)方對(duì)HCASMC炎性活化過(guò)程中TLR4-MyD88信號(hào)通路的影響及可能機(jī)制,為下一步絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物抗再狹窄的效應(yīng)機(jī)制研究打開突破口。目的本課題利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)HCASMC炎性活化,觀察絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物對(duì)HCASMC炎性活化過(guò)程中TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路的影響并尋找其作用靶點(diǎn),從炎癥角度探究絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物抗支架內(nèi)再狹窄的可能機(jī)制,為中藥復(fù)合單體涂層支架/球囊的研發(fā)提供新思路。方法1、HCASMC的體外培養(yǎng)將購(gòu)買的第二代HCASMC用無(wú)雙抗培養(yǎng)基進(jìn)行規(guī)范復(fù)蘇、傳代,建立第4～6代穩(wěn)定的HCASMC作為后續(xù)細(xì)胞研究載體。2、建立LPS誘導(dǎo)HCASMC炎性活化細(xì)胞模型,最大化激活TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路2.1用MTT法摸索出LPS造模的無(wú)毒性濃度范圍;2.2綜合利用ELISA、Q-PCR、Western blot法進(jìn)一步篩選出LPS刺激HCASMC處于高炎性活化狀態(tài),且TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路關(guān)鍵位點(diǎn)及下游炎癥產(chǎn)物的基因和蛋白表達(dá)均達(dá)到最大值的LPS濃度和刺激時(shí)間作為最佳造模條件,為下一步的絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物的機(jī)制研究提供平臺(tái)。3、探究絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物對(duì)HCASMC炎性活化過(guò)程中TLR4-MyD88信號(hào)通路的影響3.1用MTT法篩選出絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物干預(yù)HCASMC的無(wú)毒性濃度范圍,使細(xì)胞活力保持在90%以上;3.2綜合利用ELISA、Q-PCR、Western blot法檢測(cè)絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)處理后TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路關(guān)鍵位點(diǎn)及下游炎癥產(chǎn)物基因和蛋白表達(dá)的變化,初步鎖定絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物的抗炎作用位點(diǎn)。4、探索絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物抑制LPS誘導(dǎo)HCASMC炎性活化過(guò)程中TLR4-MyD88信號(hào)通路的可能機(jī)制4.1設(shè)計(jì)HCASMC特異性MyD88 siRNA,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建MyD88敲減細(xì)胞模型;4.2通過(guò)敲減MyD88或加入蛋白酶體抑制劑環(huán)氧酶素(Epoxomocin)選擇性阻斷MyD88降解,用 ELISA、Q-PCR、Western blot 法檢測(cè)絡(luò)風(fēng)寧 0 號(hào)處理后 TLR4/MyD88/NF-κB炎癥通路關(guān)鍵位點(diǎn)及下游炎癥產(chǎn)物基因和蛋白表達(dá)的變化,探索絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物是否是通過(guò)作用于TLR4/MyD88/NF-κ B通路中MyD88節(jié)點(diǎn),影響蛋白降解途徑而下調(diào)炎癥反應(yīng),初步揭示絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物的抗炎作用強(qiáng)度、作用靶點(diǎn)及分子機(jī)理。結(jié)果1、LPS誘導(dǎo)HCASMC炎性活化細(xì)胞模型的無(wú)毒性濃度范圍低中濃度(0~10 μ g/mL)的LPS與空白對(duì)照組相比對(duì)HCASMC的活力無(wú)明顯影響(細(xì)胞活力保持在90%以上),而高濃度(100μg/mL)LPS則對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響(細(xì)胞活力80.1%),因此將LPS誘導(dǎo)HCASMC的無(wú)毒性濃度范圍定為:0~10μg/mL。2、LPS誘導(dǎo)HCASMC炎性活化的最佳造模條件2.1 HCASMC 在不同濃度 LPS(0.01、0.1、0.5、1、10ug/mL)刺激 24h 后,在光鏡下可見細(xì)胞數(shù)目呈劑量依賴性增加,其中LPS濃度為0.5、1、10 ug/mL時(shí)細(xì)胞增殖活躍。2.2 ELISA結(jié)果可見0.5和1 u g/mL LPS干預(yù)48h可同時(shí)激活HCASMC大量分泌IL-6,TNF-α和IL-1β,與空白對(duì)照組相比差異明顯(P0.05)。2.3 Q-PCR結(jié)果顯示1 u g/mL LPS干預(yù)48h可同時(shí)激活HCASMC上調(diào)TLR4,MyD88,NF-κB p65,IL-6,TNF-a和IL-1β mRNA表達(dá),與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.4 Western blot 可見 1 μ g/mL LPS 干預(yù) 48h 可同時(shí)激活 HCASMC 上調(diào) TLR4,MyD88 和NF-κB p65蛋白表達(dá)。故1μg/mL的LPS干預(yù)HCASMC 48h能保證HCASMC處于持續(xù)的高炎性活化狀態(tài),最大限度激活TLR4-MyD88信號(hào)通路,可作為HCASMC炎性活化細(xì)胞模型的最佳造模條件。3、絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物對(duì)HCASMC炎性活化過(guò)程中TLR4-MyD88信號(hào)通路的影響3.1 MTT法篩選絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物的無(wú)毒性濃度范圍為:大濃度組1 μmol/L的紫杉醇+0.2mg/mL水蛭素(細(xì)胞活力保持在92%);小濃度組lμmol/L的紫杉醇+0.0125mg/mL水蛭素(細(xì)胞活力100%)。3.2 ELISA結(jié)果顯示絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物可下調(diào)炎性活化過(guò)程中IL-6,TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)量,絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)大、小濃度組與炎性活化模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中大濃度組的抗炎作用更明顯。3.3 Q-PCR結(jié)果顯示絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)大、小濃度組均可下調(diào)IL-6,TXF-a,IL-1 β,TLR4和NF-κ B p65的mRNA表達(dá),與炎性活化模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但不影響MyD88基因表達(dá)(P0.05)。3.4 Western blot結(jié)果表明絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物可下調(diào)炎性活化后TLR4、MyD88和NF-κ B p65蛋白表達(dá)。4、絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物抑制LPS誘導(dǎo)HCASMC炎性活化過(guò)程中TLR4-MyD88信號(hào)通路的可能機(jī)制4.1 Q-PCR結(jié)果顯示Epoxomicin不影響絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物干預(yù)HCASMC后MyD88的基因表達(dá)(P0.05),高濃度Epoxomicin(1μM)可通過(guò)阻斷MyD88降解的方式削弱絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物對(duì)下游炎癥因子IL-6,TNF-a,IL-1 β基因表達(dá)的抑制作用,與空白對(duì)照組及炎癥模型組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.2 ELISA結(jié)果表明高濃度Epoxomicin(1 μM)可通過(guò)阻斷MyD88降解的方式削弱絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物對(duì)下游炎癥因子IL-6,TNF-a,IL-1β蛋白表達(dá)的抑制作用,與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與炎癥模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.3 Western blot結(jié)果顯示低、高濃度的Epoxomicin均可通過(guò)阻斷MyD88降解的方式削弱絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物對(duì)炎性活化后TLR4、MyD88和NF-κ B p65蛋白表達(dá)的抑制作用,其中高濃度Epoxomicin對(duì)絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)抗炎作用的抑制強(qiáng)度更大。結(jié)論1、絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物有抑制血管局部炎癥反應(yīng)的作用;2、絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路而起到抗炎作用;3、絡(luò)風(fēng)寧0號(hào)支架涂層復(fù)合物通過(guò)作用于TLR4/MyD88/NF-κ B通路中MyD88節(jié)點(diǎn),促進(jìn)MyD88蛋白在蛋白酶體途徑降解,從而下調(diào)TLR4、NF-κ B p65活性,減弱LPS啟動(dòng)的以IL-1 β、IL-6、TNF-α為代表的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐林;胡敏;李鐘輝;范建楠;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人工支架材料治療骨缺損的研究進(jìn)展[J];昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2017年02期

2 趙惠;李瀟;金柱坤;楊凱;;影響種植支架材料生物相容性的因素[J];國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2014年03期

3 張楊;尚萬(wàn)兵;;硫酸鈣/富血小板血漿活性支架材料的制備[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2012年08期

4 張凱;王大平;朱偉民;劉建全;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與納米羥基磷灰石支架材料的體外相容性研究[J];中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志;2011年02期

5 余杰;鄧輝;金向青;曹金芳;;人牙周膜成纖維細(xì)胞與殼聚糖/磷酸三鈣支架材料體外培養(yǎng)的研究[J];現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué);2010年01期

6 武日東;唐慶;;合成及天然支架材料在皮膚組織工程中的應(yīng)用[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年12期

7 吳邦耀;羅卓荊;孟浩;胡學(xué)昱;張永光;李沫;;膠原-明膠支架材料交聯(lián)改性的制備及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2007年06期

8 孟浩;羅卓荊;馮林杰;王亮;;新型神經(jīng)支架材料的構(gòu)建及其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)矯形外科雜志;2007年12期

9 侯銳;程曉兵;毛天球;陳富林;楊耀武;吳煒;;多孔β-磷酸三鈣陶瓷支架材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及分化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2006年03期

10 高珊;趙莉;崔磊;曹誼林;;殼聚糖-明膠支架材料的制備及性能研究[J];組織工程與重建外科雜志;2005年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 吳小紅;;小鼠顱骨缺損器官培養(yǎng)模型:一種評(píng)價(jià)支架材料骨修復(fù)能力的新方法[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔材料專業(yè)委員會(huì)第九次全國(guó)口腔材料學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2014年

2 葛少華;;支架材料和誘導(dǎo)因子在組織再生中的應(yīng)用[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔醫(yī)學(xué)科研管理分會(huì)第二次學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2017年

3 原林;戴景興;陳英;;組織工程化同種異體皮膚支架材料的實(shí)驗(yàn)研究[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

4 房萬(wàn)才;楊伯光;李俊杰;王常勇;姚芳蓮;;具有抗氧化能力的導(dǎo)電支架材料研制及性能評(píng)價(jià)[A];2015年全國(guó)高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)論文摘要集——主題F-生物醫(yī)用高分子[C];2015年

5 王靜;孟祥才;李幕勤;趙麗;;新型羥基磷灰石基支架材料的細(xì)胞相容性研究[A];第十二屆中國(guó)體視學(xué)與圖像分析學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

6 趙斌;馬信龍;孫曉雷;李秀蘭;馬劍雄;徐康;張楊;郭躍;;低滲聯(lián)合凍干改良制備脫細(xì)胞神經(jīng)支架材料的研究[A];第十九屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2012年

7 楊光輝;王英杰;張世昌;劉濤;;聚氨酯支架材料內(nèi)肝細(xì)胞培養(yǎng)的初步研究[A];第一屆全國(guó)疑難重型肝病大會(huì)、第四屆全國(guó)人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

8 宋英翠;李勃;李亞運(yùn);;直寫三維無(wú)模成型技術(shù)制備生物醫(yī)用支架材料[A];第十七屆全國(guó)高技術(shù)陶瓷學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集[C];2012年

9 李瑞欣;李東;冷雪;趙濱;李昊;蘇衛(wèi)華;侍才洪;李煜;王強(qiáng)松;韓標(biāo);張西正;;力學(xué)作用下細(xì)胞/支架材料體外、體內(nèi)成骨效應(yīng)[A];第十一屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十三屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要匯編[C];2015年

10 顧刈非;張欣;黃文e

本文編號(hào)：2794229