【摘要】：背景介入術后支架內再狹窄及支架內血栓形成是血管介入領域所面臨的巨大挑戰(zhàn),目前新一代藥物支架血栓發(fā)生率已降至0.2%,但再狹窄率仍未得到有效控制,嚴重影響介入術后患者的生存質量和遠期預后,如何把支架內再狹窄和血栓形成風險降至最低始終是國內外介入器械研發(fā)的焦點與前沿領域。導師王顯教授基于心脈病證絡風內動病機理論,創(chuàng)新中藥單體給藥途徑,將紅豆杉、水蛭的單體成分紫杉醇、水蛭素組成絡風寧0號方涂載于冠脈支架表面,制備出新型絡風寧0號涂層支架用于心血管急癥的中西醫(yī)結合介入治療。目前絡風寧0號支架涂層復合物已拓展應用于藥物球囊和可降解支架的研發(fā),并在小型豬實驗中初步證實其安全性及有效性,尤其在防治管腔再狹窄和血栓形成方面所凸顯的優(yōu)勢更是令人振奮,但其微觀生物學機制仍需深入探索。本團隊既往研究發(fā)現,絡風內動證患者體內處于高炎癥狀態(tài),現代研究亦表明冠脈介入術后炎癥微環(huán)境與支架內再狹窄和血栓形成密切相關,炎性活化的平滑肌細胞增殖遷移是再狹窄發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié),而抗炎在介入術后再狹窄的治療中具備有效性,這給我們提供了啟示,絡風內動病機理論指導下的絡風寧0號支架涂層復合物防治PCI術后再狹窄的效應機制可能與其對炎癥微環(huán)境下血管平滑肌細胞的調控作用有關。進而我們從炎癥角度切入,將目光鎖定于經典的TLR4-MyD88炎癥通路,以人冠狀動脈平滑肌細胞(HCASMC)作為研究載體,探究絡風寧0號方對HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88信號通路的影響及可能機制,為下一步絡風寧0號支架涂層復合物抗再狹窄的效應機制研究打開突破口。目的本課題利用脂多糖(LPS)誘導HCASMC炎性活化,觀察絡風寧0號支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路的影響并尋找其作用靶點,從炎癥角度探究絡風寧0號支架涂層復合物抗支架內再狹窄的可能機制,為中藥復合單體涂層支架/球囊的研發(fā)提供新思路。方法1、HCASMC的體外培養(yǎng)將購買的第二代HCASMC用無雙抗培養(yǎng)基進行規(guī)范復蘇、傳代,建立第4～6代穩(wěn)定的HCASMC作為后續(xù)細胞研究載體。2、建立LPS誘導HCASMC炎性活化細胞模型,最大化激活TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路2.1用MTT法摸索出LPS造模的無毒性濃度范圍;2.2綜合利用ELISA、Q-PCR、Western blot法進一步篩選出LPS刺激HCASMC處于高炎性活化狀態(tài),且TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路關鍵位點及下游炎癥產物的基因和蛋白表達均達到最大值的LPS濃度和刺激時間作為最佳造模條件,為下一步的絡風寧0號支架涂層復合物的機制研究提供平臺。3、探究絡風寧0號支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88信號通路的影響3.1用MTT法篩選出絡風寧0號支架涂層復合物干預HCASMC的無毒性濃度范圍,使細胞活力保持在90%以上;3.2綜合利用ELISA、Q-PCR、Western blot法檢測絡風寧0號處理后TLR4/MyD88/NF-κ B炎癥通路關鍵位點及下游炎癥產物基因和蛋白表達的變化,初步鎖定絡風寧0號支架涂層復合物的抗炎作用位點。4、探索絡風寧0號支架涂層復合物抑制LPS誘導HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88信號通路的可能機制4.1設計HCASMC特異性MyD88 siRNA,利用脂質體轉染法構建MyD88敲減細胞模型;4.2通過敲減MyD88或加入蛋白酶體抑制劑環(huán)氧酶素(Epoxomocin)選擇性阻斷MyD88降解,用 ELISA、Q-PCR、Western blot 法檢測絡風寧 0 號處理后 TLR4/MyD88/NF-κB炎癥通路關鍵位點及下游炎癥產物基因和蛋白表達的變化,探索絡風寧0號支架涂層復合物是否是通過作用于TLR4/MyD88/NF-κ B通路中MyD88節(jié)點,影響蛋白降解途徑而下調炎癥反應,初步揭示絡風寧0號支架涂層復合物的抗炎作用強度、作用靶點及分子機理。結果1、LPS誘導HCASMC炎性活化細胞模型的無毒性濃度范圍低中濃度(0~10 μ g/mL)的LPS與空白對照組相比對HCASMC的活力無明顯影響(細胞活力保持在90%以上),而高濃度(100μg/mL)LPS則對細胞活力產生影響(細胞活力80.1%),因此將LPS誘導HCASMC的無毒性濃度范圍定為:0~10μg/mL。2、LPS誘導HCASMC炎性活化的最佳造模條件2.1 HCASMC 在不同濃度 LPS(0.01、0.1、0.5、1、10ug/mL)刺激 24h 后,在光鏡下可見細胞數目呈劑量依賴性增加,其中LPS濃度為0.5、1、10 ug/mL時細胞增殖活躍。2.2 ELISA結果可見0.5和1 u g/mL LPS干預48h可同時激活HCASMC大量分泌IL-6,TNF-α和IL-1β,與空白對照組相比差異明顯(P0.05)。2.3 Q-PCR結果顯示1 u g/mL LPS干預48h可同時激活HCASMC上調TLR4,MyD88,NF-κB p65,IL-6,TNF-a和IL-1β mRNA表達,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.4 Western blot 可見 1 μ g/mL LPS 干預 48h 可同時激活 HCASMC 上調 TLR4,MyD88 和NF-κB p65蛋白表達。故1μg/mL的LPS干預HCASMC 48h能保證HCASMC處于持續(xù)的高炎性活化狀態(tài),最大限度激活TLR4-MyD88信號通路,可作為HCASMC炎性活化細胞模型的最佳造模條件。3、絡風寧0號支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88信號通路的影響3.1 MTT法篩選絡風寧0號支架涂層復合物的無毒性濃度范圍為:大濃度組1 μmol/L的紫杉醇+0.2mg/mL水蛭素(細胞活力保持在92%);小濃度組lμmol/L的紫杉醇+0.0125mg/mL水蛭素(細胞活力100%)。3.2 ELISA結果顯示絡風寧0號支架涂層復合物可下調炎性活化過程中IL-6,TNF-α和IL-1β蛋白表達量,絡風寧0號大、小濃度組與炎性活化模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中大濃度組的抗炎作用更明顯。3.3 Q-PCR結果顯示絡風寧0號大、小濃度組均可下調IL-6,TXF-a,IL-1 β,TLR4和NF-κ B p65的mRNA表達,與炎性活化模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但不影響MyD88基因表達(P0.05)。3.4 Western blot結果表明絡風寧0號支架涂層復合物可下調炎性活化后TLR4、MyD88和NF-κ B p65蛋白表達。4、絡風寧0號支架涂層復合物抑制LPS誘導HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88信號通路的可能機制4.1 Q-PCR結果顯示Epoxomicin不影響絡風寧0號支架涂層復合物干預HCASMC后MyD88的基因表達(P0.05),高濃度Epoxomicin(1μM)可通過阻斷MyD88降解的方式削弱絡風寧0號支架涂層復合物對下游炎癥因子IL-6,TNF-a,IL-1 β基因表達的抑制作用,與空白對照組及炎癥模型組相比均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.2 ELISA結果表明高濃度Epoxomicin(1 μM)可通過阻斷MyD88降解的方式削弱絡風寧0號支架涂層復合物對下游炎癥因子IL-6,TNF-a,IL-1β蛋白表達的抑制作用,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與炎癥模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.3 Western blot結果顯示低、高濃度的Epoxomicin均可通過阻斷MyD88降解的方式削弱絡風寧0號支架涂層復合物對炎性活化后TLR4、MyD88和NF-κ B p65蛋白表達的抑制作用,其中高濃度Epoxomicin對絡風寧0號抗炎作用的抑制強度更大。結論1、絡風寧0號支架涂層復合物有抑制血管局部炎癥反應的作用;2、絡風寧0號支架涂層復合物通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路而起到抗炎作用;3、絡風寧0號支架涂層復合物通過作用于TLR4/MyD88/NF-κ B通路中MyD88節(jié)點,促進MyD88蛋白在蛋白酶體途徑降解,從而下調TLR4、NF-κ B p65活性,減弱LPS啟動的以IL-1 β、IL-6、TNF-α為代表的炎癥反應。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

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本文編號：2794229