【摘要】：牙髓間充質(zhì)細(xì)胞(Dental Mesenchymal cells)是牙髓組織中具有多向分化能力的細(xì)胞,可應(yīng)對(duì)許多損傷反應(yīng),如遷移至齲病損傷區(qū)域,形成修復(fù)性牙本質(zhì)抵御外界刺激。因此,任何干擾人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活性的臨床操作都可能引起牙髓組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的嚴(yán)重改變。復(fù)合樹(shù)脂材料因其具有美觀、簡(jiǎn)易操作及安全性能等,近來(lái)成為牙科充填治療和粘結(jié)修復(fù)的主要生物材料。二甲基丙烯酸羥乙酯(2-Hydroxyethyl methacrylate,HEMA)是復(fù)合樹(shù)脂材料基質(zhì)中主要的單體成分,是一種中性親水單體。HEMA具有其親水性和低分子量等特征,通過(guò)與水競(jìng)爭(zhēng),浸潤(rùn)、滲透入牙本質(zhì)有機(jī)基質(zhì)網(wǎng)中,促進(jìn)樹(shù)脂流動(dòng)和分散,有效增強(qiáng)樹(shù)脂與牙本質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度。其特性同時(shí)也使HEMA在牙科治療過(guò)程中,易于從未聚合完全的樹(shù)脂中游離出來(lái),通過(guò)牙本質(zhì)小管擴(kuò)散至口腔組織中,引起組織細(xì)胞毒性反應(yīng)。然而,HEMA對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制仍未被闡明。細(xì)胞自噬(Autophagy)是一種高度保守的細(xì)胞代謝程序,通過(guò)將細(xì)胞內(nèi)成分輸送至溶酶體進(jìn)行降解來(lái)控制蛋白的質(zhì)量。在正常生理?xiàng)l件下,自噬對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。在應(yīng)激或病理?xiàng)l件下,細(xì)胞自噬可以被大量激活,消化降解細(xì)胞內(nèi)多余的蛋白以及功能受損傷的細(xì)胞器,達(dá)到維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。近來(lái)自噬被發(fā)現(xiàn)在口腔疾病領(lǐng)域發(fā)揮重要作用,包括參與單體誘發(fā)的細(xì)胞毒性。而HEMA單體對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬水平的作用尚無(wú)研究。細(xì)胞凋亡(Apoptosis),即Ⅰ型細(xì)胞程序性死亡,是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的重要機(jī)制,可激活特殊酶蛋白-半胱天冬酶。半胱天冬酶是迅速分解轉(zhuǎn)移細(xì)胞器和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要蛋白酶。細(xì)胞凋亡參與許多細(xì)胞損傷和應(yīng)激,也參與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和分化過(guò)程。當(dāng)機(jī)體受疾病或有害物質(zhì)危害時(shí),細(xì)胞凋亡發(fā)揮防御機(jī)制,如免疫反應(yīng)等。細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡是生物學(xué)上緊密關(guān)聯(lián)的兩種過(guò)程,在不同的環(huán)境下二者之間的關(guān)系也不同。核因子κB(NF-κB)屬于轉(zhuǎn)錄因子家族,在許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵作用。它可能通過(guò)調(diào)控不同的靶點(diǎn)而發(fā)揮抗凋亡或者親和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子的作用。NF-κB也調(diào)節(jié)參與自噬,在不同環(huán)境條件下促進(jìn)或抑制自噬發(fā)生。HEMA單體誘發(fā)多種類型細(xì)胞的毒性機(jī)制與凋亡的發(fā)生有關(guān),且NF-κ B信號(hào)通路參與HEMA引起的細(xì)胞毒性過(guò)程。而自噬在HEMA處理的牙髓間充質(zhì)細(xì)胞中的作用尚無(wú)研究,且自噬對(duì)HEMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用也尚未明確。故本課題旨在研究HEMA是否影響牙髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬水平,并進(jìn)一步探討自噬對(duì)HEMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制。研究一 HEMA誘導(dǎo)人牙源性間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡的體外研究目的:明確HEMA的物理化學(xué)性質(zhì),研究HEMA對(duì)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖、凋亡及活性氧水平等生物學(xué)行為的影響。方法:通過(guò)衰減全反射率傅立葉紅外光譜(ATR-FTIR)和顯微拉曼光譜(LabRAM,HoribaJobinYvon,France)確定樹(shù)脂單體HEMA的理化性質(zhì)。收集健康年輕前磨牙和第三磨牙,獲取牙髓間充質(zhì)細(xì)胞。用完全細(xì)胞培養(yǎng)基將HEMA稀釋成不同濃度(0,1,2,4,6,8,10mM)后,對(duì)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)不同時(shí)間(12,24,48,96h)。使用Cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒檢測(cè)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的活性和增殖情況,Annexin V-PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞凋亡情況,Hochest熒光染色觀察牙髓間充質(zhì)細(xì)胞核變化。DCF-DA染色-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧聚集。Hochest熒光染色檢測(cè)細(xì)胞核改變。結(jié)果:HEMA以濃度依賴和時(shí)間依賴的方式降低牙髓間充質(zhì)細(xì)胞活力。8mM HEMA處理48小時(shí)組可觀察到明顯的細(xì)胞活力下降(約60%)。早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率與HEMA處理濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)。8mM HEMA處理48小時(shí)組細(xì)胞凋亡率達(dá)近40%。HEMA以濃度依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧聚集。HEMA處理組細(xì)胞核呈現(xiàn)凋亡特征改變。結(jié)論:HEMA對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞活力的抑制和對(duì)細(xì)胞凋亡率的促進(jìn)呈濃度依賴和時(shí)間依賴;HEMA以時(shí)間依賴方式促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加。研究二HEMA通過(guò)自噬途徑誘導(dǎo)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡的體外研究目的:探究HEMA對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞自噬水平的影響,明確細(xì)胞自噬在HEMA誘導(dǎo)的牙髓間充質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用,以及激活自噬的相關(guān)機(jī)制。方法:吖啶橙(AO)和單丹磺腺尸胺(MDC)染色探究細(xì)胞內(nèi)酸性泡和自噬泡的形成水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析自噬相關(guān)mRNA(Beclin 1和LC3)的表達(dá)水平;細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白(Beclin 1、Atg5和LC3)的表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白(ULK1、Beclin 1、Atg5和LC3)的表達(dá)水平;透射電鏡觀察細(xì)胞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)內(nèi)自噬體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。細(xì)胞自噬抑制劑(氯喹,CQ和3-甲基腺嘌呤,3-MA)和NF-κB抑制劑BAY 11-7082[(E)-3-(對(duì)甲苯磺酰基)]預(yù)處理牙髓間充質(zhì)細(xì)胞,以抑制細(xì)胞自噬水平,檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:HEMA促進(jìn)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)橙紅色吖啶橙染的酸性泡數(shù)量增加,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)MDC染的亮綠色自噬泡的數(shù)目顯著增加。細(xì)胞經(jīng)HEMA處理后,Beclin 1和LC3 mRNA表達(dá)水平顯著增加。免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示HEMA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Beclin 1、Atg5和LC3蛋白水平顯著提高。透射電鏡結(jié)果提示HEMA促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬體和溶酶體數(shù)量增加。細(xì)胞自噬抑制劑CQ和3-MA可逆轉(zhuǎn)HEMA誘導(dǎo)的自噬水平,降低Beclin 1、Atg5和LC3的表達(dá)。CQ和3-MA也可逆轉(zhuǎn)HEMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平,明顯降低早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量。HEMA可誘導(dǎo)NF-κ B p65的核轉(zhuǎn)錄和磷酸化,且NF-κ B信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082可明顯阻滯細(xì)胞內(nèi)自噬水平。NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082也可顯著抑制HEMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平。結(jié)論:HEMA通過(guò)NF-κ B-自噬軸誘導(dǎo)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡發(fā)生研究三HEMA對(duì)離體人牙髓組織中細(xì)胞自噬和凋亡水平的作用及機(jī)制研究目的:通過(guò)離體培養(yǎng)人牙髓組織器官,模擬體內(nèi)環(huán)境,探索HEMA對(duì)牙髓組織的毒性作用,以及其對(duì)牙髓組織中自噬水平和NF-κ B信號(hào)通路的表達(dá)情況的影響。方法:獲得新鮮離體人牙體組織進(jìn)行組織切片器官培養(yǎng)。8 mM HEMA處理牙切片不同時(shí)間(12,24,48h)后,對(duì)牙切片進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn),檢測(cè)牙髓組織中細(xì)胞的活力。蘇木素-伊紅染色檢測(cè)牙髓組織的形態(tài)特征和細(xì)胞分布。透射電鏡觀察牙髓組織內(nèi)超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的形態(tài),包括自噬體的數(shù)量和細(xì)胞核的變化。組織免疫熒光染色檢測(cè)HEMA處理后的牙髓組織內(nèi)Beclin 1和NF-κ B p65的表達(dá)情況。結(jié)果:HEMA明顯抑制牙髓組織內(nèi)細(xì)胞活力,呈時(shí)間依賴性。蘇木素-伊紅染色顯示HEMA處理組牙髓組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,且細(xì)胞核濃縮深染。透射電鏡顯示HEMA處理組牙髓組織內(nèi)細(xì)胞核呈凋亡性改變,且自噬體和溶酶體數(shù)量顯著增加。組織免疫熒光證實(shí)HEMA可促進(jìn)牙髓組織細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá)增加,且NF-κB p65的胞質(zhì)表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄也明顯增加。結(jié)論:HEMA抑制牙髓組織內(nèi)細(xì)胞活力,激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡水平的增加。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R783.1
【圖文】：

二甲基丙烯酸羥乙酯對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的毒性作用及機(jī)制研究天后觀察Ｐ０代細(xì)胞貼壁，并更換４邋ｍｌ含２０％邋ＦＢＳ和１％雙抗的ａ邋－ＭＥＭ完基，待細(xì)胞擴(kuò)增并融合至瓶底面積８０％時(shí)進(jìn)行傳代為Ｐ１代。逡逑培養(yǎng)ＤＭＣＳｓ細(xì)胞經(jīng)Ｓ－Ｐ免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)波形絲蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ，Ｖｉｍ）及（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，Ｃｋ）的表達(dá)情況，并進(jìn)行ＡＬＰ染色，ＡＬＰ顯色液為３－溴－４－哚磷酸鹽（ＢＣＩＰ）和硝基藍(lán)四哩鹽（ＮＢＴ）配制而成。甘油封片后，光鏡下觀著色情況，結(jié)合取材部位，證實(shí)細(xì)胞來(lái)源。逡逑第４－６代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．待Ｐ１代細(xì)胞擴(kuò)增至９０％，將其凍存?zhèn)溆�。將第４－胞用于�?shí)驗(yàn)研宄。逡逑＇ｈ：邋＂逡逑

１６３５邋ｃｍ－１邋（Ｃ＝Ｃ），１２５０邋ｃｎＴ１邋（Ｃ－Ｏ—Ｃ），１１５２邋ｃｍ－１邋（Ｃ＝０），ａｎｄ邋７４９邋ｃｎｆ１邋（ＣＨ２）處可觀逡逑察到典型的吸收峰（圖１－２Ａ）。微拉曼光譜顯示出特征的甲基丙烯酸酯譜段：ＣＣＯ邋（６０５逡逑ｃｍ＇１），邋ＣＨ２邋（１４５３邋ｃｍ＇１），邋Ｃ＝Ｃ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｂｏｎｄ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｐｅａｋｓ邋（１４１０邋ａｎｄ邋１６４０邋ｃｍ＂＇），逡逑ａｎｄ邋ｃａｒｂｏｎｙｌ邋（１７２０邋ｃｍ－１）（圖邋１－２邋Ｂ）。逡逑Ｈ逡逑４０００邐３５００邐３０００邐２５００邐２０００邐１５００邐１０００邐５００逡逑Ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒ邋（ｃｍ邋１）逡逑Ｂ逡逑0逡逑妄邐力＃。？ｏｈ逡逑＾邐Ｉ邐ＨＥＭＡ逡逑？邐－逡逑？Ｅ邐Ｓ邐５逡逑２邐１１１邐ｌ邐Ｉ邋１逡逑２０００邋１８００邋１６００邋１４００邋１２００邋１０００邋８００邐６００邋４００邐２００逡逑Ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒ／ｃｍ邋１逡逑圖１－２：衰減全反射率傅立葉紅外光譜（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）邋（Ａ）和顯微拉曼光譜（Ｂ）來(lái)逡逑檢測(cè)樹(shù)脂單體ＨＥＭＡ的物理化學(xué)性質(zhì)。逡逑２邋ＨＥＭＡ對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖的作用逡逑將含不同濃度（０，１，邋２，邋４，６，邋８，邋１０邋ｍＭ）ＨＥＭＡ的完全培養(yǎng)基對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞逡逑進(jìn)行培養(yǎng)１２，邋２４，邋４８，和９６小時(shí)后，利用ＣＣＫ－８試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示在逡逑２１逡逑

相同濃度處理下，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活力下降？，在相同處理時(shí)間內(nèi)，隨著ＨＥＭＡ逡逑濃度增加，細(xì)胞活力下降。８ｍＭＨＥＭＡ處理４８小時(shí)后，細(xì)胞活力降至約５０％，提示明逡逑顯的毒性作用（圖１－３）。逡逑１４０－逡逑■邋１２ｈ逡逑１２０＇邐Ｔ邐■施逡逑１００－邐－ｉ邋７邐ｍ邋４８ｈ逡逑ｌｌｌＵＨ逡逑０１２４邐６８１０逡逑ＨＥＭＡ（ｍＭ）逡逑圖１－３：使用不同濃度ＨＥＭＡ（０，邋１，２，４，邋６，８，１０邋ｒａＭ）對(duì)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞培逡逑養(yǎng)１２，邋２４，邋４８，和９６小時(shí)后，ＣＣＫ８測(cè)試細(xì)胞體外活性。逡逑３邋ＨＥＭＡ對(duì)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用逡逑Ｈｏｅｃｈｓｔ邋３３３４２是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料。生理?xiàng)l件下Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑３３３４２能少量進(jìn)入正�；罴�(xì)胞的細(xì)胞膜，使其染上低亮度藍(lán)色；而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，逡逑凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Ｈｏｅｃｈｓｔ比正常細(xì)胞的多，熒光逡逑強(qiáng)度較正常細(xì)胞中要高，呈亮藍(lán)色。此外，凋亡細(xì)胞的染色體ＤＮＡ的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改逡逑變，也使該染料能更有效地與ＤＮＡ結(jié)合。另外凋亡細(xì)胞膜上的ｐ－糖蛋白泵功能受損，逡逑無(wú)法有效地將Ｈｏｅｃｈｓｔ排出細(xì)胞，使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加，也使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒逡逑光增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王仲濤;;上皮與間充質(zhì)在發(fā)育中的相互作用(講座)[J];河北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1988年01期

2 張鋒;鄧旭亮;梅芳;王新知;;空間微重力環(huán)境對(duì)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的影響初探[J];科技導(dǎo)報(bào);2007年02期

3 黃銳,劉寧,王孝英;胃惡性間充質(zhì)細(xì)胞瘤一例[J];臨床放射學(xué)雜志;2003年01期

4 楊汝春;魯盈;朱曉玲;王永鈞;;白介素-1β誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2007年11期

5 張光東,金巖,史俊南,聶鑫,鄧蔓菁,張勇杰,劉源,趙宇;大鼠外胚間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化——三維誘導(dǎo)模型的建立[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2003年03期

6 張光東,金巖,史俊南,鄧蔓菁,聶鑫;胰島素樣生長(zhǎng)因子1誘導(dǎo)外胚間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2003年02期

7 鄧蔓菁,金巖,史俊南,劉源,趙宇;胚胎面突外胚間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及向平滑肌細(xì)胞的自分化研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2003年05期

8 王立平,黨耕町;未分化間充質(zhì)細(xì)胞成骨作用的研究進(jìn)展[J];中華外科雜志;1998年02期

9 譚紅;鄧婷婷;聶敏海;;口腔鱗狀細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換作用的研究進(jìn)展[J];實(shí)用醫(yī)院臨床雜志;2014年03期

10 劉婷;王立斌;馬曉娜;朱永朝;馬麗君;范恒;李玉奎;魏軍;;體外分步誘導(dǎo)人母體來(lái)源胎盤間充質(zhì)細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2011年26期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 閆征斌;劉磊;田衛(wèi)東;林云鋒;李志勇;;第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞牙向分化上調(diào)基因組抑制消減文庫(kù)的建立[A];2007年第七次全國(guó)牙體牙髓病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

2 李曉東;田衛(wèi)東;江宏兵;陳希哲;湯煒;鄭曉輝;劉磊;;外源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)胎鼠牙胚間充質(zhì)細(xì)胞牙向分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];2004年中國(guó)口腔頜面修復(fù)重建外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

3 趙麗麗;王二云;高倩;楊公社;;脂肪間充質(zhì)細(xì)胞體外分化成心肌細(xì)胞的研究[A];中國(guó)動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國(guó)動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2009年

4 鄧蔓菁;劉魯川;陳小紅;安建平;匡桂英;AJ Smith;;多種生長(zhǎng)因子對(duì)胚胎面突外胚間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用[A];2007年第七次全國(guó)牙體牙髓病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

5 江宏兵;田衛(wèi)東;陳希哲;湯煒;劉磊;李曉東;;誘導(dǎo)顱神經(jīng)嵴向第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];2004年中國(guó)口腔頜面修復(fù)重建外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

6 鄭黎薇;葉玲;張艷;周學(xué)東;;人牙間充質(zhì)細(xì)胞的成牙誘導(dǎo)能力[A];全國(guó)第八次牙體牙髓病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

7 鄭敏;滿孝勇;李偉;周炯;陳佳琦;李春明;蔡綏R

本文編號(hào)：2752741