發(fā)布時(shí)間：2020-07-10 00:01

【摘要】：目的:皮膚的大面積缺損往往因自體供皮不足問題難以完全愈合。本研究旨在探索應(yīng)用細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建組織工程真皮的新策略,為皮膚創(chuàng)面的修復(fù)和愈合提供新思路。方法:(1)運(yùn)用全骨髓貼壁法獲得rBMSCs(rabbit Bone marrow mesenchymal stem cells rBMSCs),復(fù)蘇擴(kuò)增培養(yǎng)HUVECs(Human umbilical vein endothelial cells HUVECs)、HDFs(Human dermal fibroblasts HDFs),倒置相差顯微鏡下觀察種子細(xì)胞的形態(tài)與生長狀態(tài)。(2)取P2代rBMSCs,以9×10~4cell/cm~2的密度接種于六孔板內(nèi);HDFs在相同條件下培養(yǎng);兩種細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)14天收獲單層細(xì)胞膜片,以5×10~4cell/cm~2的密度將HUVECs均勻接種于所獲得的未分化rBMSCs膜片上,形成預(yù)血管化細(xì)胞膜片。在培養(yǎng)的1、3、7、14天,鏡下觀察膜片的微觀形貌,HE染色、CD31免疫熒光染色觀察細(xì)胞的分布及微血管網(wǎng)絡(luò)生成情況;對(duì)所構(gòu)建的成纖維細(xì)胞膜片鏡下觀察、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原免疫組化染色,評(píng)估細(xì)胞的分布及膠原的表達(dá)。(3)三維預(yù)血管化真皮樣組織的構(gòu)建:將培養(yǎng)7天的預(yù)血管化細(xì)胞膜片,夾在兩層成纖維細(xì)胞膜片中間,構(gòu)成“三明治”樣結(jié)構(gòu),之后再使用鑷子對(duì)折兩次,形成一個(gè)擁有12層膜片結(jié)構(gòu)的三維真皮樣組織,將未分化的rBMSCs膜片夾在兩層成纖維細(xì)胞膜片中間疊加后折疊作為對(duì)照組。兩組均培養(yǎng)24h后進(jìn)行組織學(xué)染色、免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果:(1)利用全骨髓貼壁法獲得的rBMSCs擁有良好的分裂增殖能力,鏡下呈不規(guī)則形、多角形。HUVECs細(xì)胞形態(tài)呈卵圓形,鋪路石樣。HDFs細(xì)胞形態(tài)呈長梭形。三種細(xì)胞均于培養(yǎng)皿底壁呈漩渦狀生長。(2)HUVECs接種于未分化rBMSCs膜片上,3天即可觀察到HUVECs在膜片表面形成的空泡狀結(jié)構(gòu);HDFs膜片上Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原均呈陽性表達(dá)。(3)所構(gòu)建的三維真皮樣組織,實(shí)驗(yàn)組見“蜂巢”狀網(wǎng)絡(luò)連接結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)量上沒有顯著差異。結(jié)論:(1)利用全骨髓貼壁法可獲得rBMSCs,傳代2次純化后可用于實(shí)驗(yàn),HUVECs和HDFs細(xì)胞生長狀態(tài)良好。(2)將HUVECs以一定密度均勻接種至未分化的rBMSCs膜片上,能夠于體外形成預(yù)血管化細(xì)胞膜片;所構(gòu)建的成纖維細(xì)胞膜片具有合成和分泌真皮組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的能力。(3)有HUVECs參與的三維真皮樣組織的基質(zhì)分布規(guī)律更為有序;所構(gòu)建的預(yù)血管化真皮樣組織短期內(nèi)未見因網(wǎng)絡(luò)血管的形成而明顯影響膠原的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318
【圖文】：

余大多數(shù)細(xì)胞呈圓形懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)。培養(yǎng) 48h 后，底壁可見大量貼壁細(xì)胞生長，數(shù)量明顯增多，不均勻鋪于瓶底。72h 后，貼壁細(xì)胞分裂增殖明顯，細(xì)胞以多角形、長梭形多見（圖1a）。培養(yǎng)原代細(xì)胞至5-6天時(shí)，可見細(xì)胞于底壁融合80%-90%，部分視野可見細(xì)胞疊層生長，此時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代過后的細(xì)胞 12h 即可貼壁伸展，此時(shí)懸浮細(xì)胞明顯減少，rBMSCs 大多為長梭形均勻貼于底壁。第 1 代細(xì)胞經(jīng)過 1-2 次換液即可鋪滿瓶底，呈漩渦狀生長（圖 1b）。圖 1 倒置相差顯微鏡下 rBMSCs 的細(xì)胞形態(tài)（a）rBMSCs P0（b）rBMSCs P1（Scale bar=100μm）3.3.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)形態(tài)觀察

圖 2 倒置相差顯微鏡下 HUVECs 的細(xì)胞形態(tài)（a）HUVECs P0（b）HUVECs P1（Scale bar=100μm）3.3.3 人皮膚成纖維細(xì)胞（HDFs）培養(yǎng)形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡下觀察 HDFs 接種 24h 后呈長梭形、多角形貼壁伸展，胞核較大，呈卵圓形靠近胞質(zhì)的中央（圖 3a）；原代培養(yǎng)約 6 天后細(xì)胞融合至可傳

圖 3 倒置相差顯微鏡下 HDFs 的細(xì)胞形態(tài)（a）HDFs P0（b）HDFs P1 （a：Scale bar=50μm，b：Scale bar=100μm）3.4 實(shí)驗(yàn)討論

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2748170