【摘要】：目的:皮膚的大面積缺損往往因自體供皮不足問題難以完全愈合。本研究旨在探索應用細胞膜片技術構建組織工程真皮的新策略,為皮膚創(chuàng)面的修復和愈合提供新思路。方法:(1)運用全骨髓貼壁法獲得rBMSCs(rabbit Bone marrow mesenchymal stem cells rBMSCs),復蘇擴增培養(yǎng)HUVECs(Human umbilical vein endothelial cells HUVECs)、HDFs(Human dermal fibroblasts HDFs),倒置相差顯微鏡下觀察種子細胞的形態(tài)與生長狀態(tài)。(2)取P2代rBMSCs,以9×10~4cell/cm~2的密度接種于六孔板內;HDFs在相同條件下培養(yǎng);兩種細胞連續(xù)培養(yǎng)14天收獲單層細胞膜片,以5×10~4cell/cm~2的密度將HUVECs均勻接種于所獲得的未分化rBMSCs膜片上,形成預血管化細胞膜片。在培養(yǎng)的1、3、7、14天,鏡下觀察膜片的微觀形貌,HE染色、CD31免疫熒光染色觀察細胞的分布及微血管網絡生成情況;對所構建的成纖維細胞膜片鏡下觀察、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原免疫組化染色,評估細胞的分布及膠原的表達。(3)三維預血管化真皮樣組織的構建:將培養(yǎng)7天的預血管化細胞膜片,夾在兩層成纖維細胞膜片中間,構成“三明治”樣結構,之后再使用鑷子對折兩次,形成一個擁有12層膜片結構的三維真皮樣組織,將未分化的rBMSCs膜片夾在兩層成纖維細胞膜片中間疊加后折疊作為對照組。兩組均培養(yǎng)24h后進行組織學染色、免疫熒光染色、免疫組織化學染色。結果:(1)利用全骨髓貼壁法獲得的rBMSCs擁有良好的分裂增殖能力,鏡下呈不規(guī)則形、多角形。HUVECs細胞形態(tài)呈卵圓形,鋪路石樣。HDFs細胞形態(tài)呈長梭形。三種細胞均于培養(yǎng)皿底壁呈漩渦狀生長。(2)HUVECs接種于未分化rBMSCs膜片上,3天即可觀察到HUVECs在膜片表面形成的空泡狀結構;HDFs膜片上Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原均呈陽性表達。(3)所構建的三維真皮樣組織,實驗組見“蜂巢”狀網絡連接結構,實驗組與對照組在Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達量上沒有顯著差異。結論:(1)利用全骨髓貼壁法可獲得rBMSCs,傳代2次純化后可用于實驗,HUVECs和HDFs細胞生長狀態(tài)良好。(2)將HUVECs以一定密度均勻接種至未分化的rBMSCs膜片上,能夠于體外形成預血管化細胞膜片;所構建的成纖維細胞膜片具有合成和分泌真皮組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的能力。(3)有HUVECs參與的三維真皮樣組織的基質分布規(guī)律更為有序;所構建的預血管化真皮樣組織短期內未見因網絡血管的形成而明顯影響膠原的表達。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318
【圖文】：

余大多數細胞呈圓形懸浮于培養(yǎng)液內。培養(yǎng) 48h 后，底壁可見大量貼壁細胞生長，數量明顯增多，不均勻鋪于瓶底。72h 后，貼壁細胞分裂增殖明顯，細胞以多角形、長梭形多見（圖1a）。培養(yǎng)原代細胞至5-6天時，可見細胞于底壁融合80%-90%，部分視野可見細胞疊層生長，此時進行傳代培養(yǎng)，傳代過后的細胞 12h 即可貼壁伸展，此時懸浮細胞明顯減少，rBMSCs 大多為長梭形均勻貼于底壁。第 1 代細胞經過 1-2 次換液即可鋪滿瓶底，呈漩渦狀生長（圖 1b）。圖 1 倒置相差顯微鏡下 rBMSCs 的細胞形態(tài)（a）rBMSCs P0（b）rBMSCs P1（Scale bar=100μm）3.3.2 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）培養(yǎng)形態(tài)觀察

圖 2 倒置相差顯微鏡下 HUVECs 的細胞形態(tài)（a）HUVECs P0（b）HUVECs P1（Scale bar=100μm）3.3.3 人皮膚成纖維細胞（HDFs）培養(yǎng)形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡下觀察 HDFs 接種 24h 后呈長梭形、多角形貼壁伸展，胞核較大，呈卵圓形靠近胞質的中央（圖 3a）；原代培養(yǎng)約 6 天后細胞融合至可傳

圖 3 倒置相差顯微鏡下 HDFs 的細胞形態(tài)（a）HDFs P0（b）HDFs P1 （a：Scale bar=50μm，b：Scale bar=100μm）3.4 實驗討論

【參考文獻】

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本文編號：2748170