【摘要】：外周神經(jīng)損傷嚴(yán)重影響了肢體的功能以及病人的生活質(zhì)量,目前仍然是臨床的難題之一,而神經(jīng)組織工程的發(fā)展為其提供了新方向。神經(jīng)導(dǎo)管支架是神經(jīng)組織工程中常用的材料,其中可生物降解的合成高分子材料,因其優(yōu)良的性質(zhì),近年來成為制備神經(jīng)導(dǎo)管支架的優(yōu)良選擇。但高分子材料導(dǎo)管一般僅能接合神經(jīng)斷端,并不具有促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)的生物特性。為了改善高分子導(dǎo)管材料的生物性質(zhì),近年來越來越多的研究者在神經(jīng)組織工程中引入可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長、髓鞘再生和軸突形成的神經(jīng)生長因子。神經(jīng)生長因子NGF是由神經(jīng)細(xì)胞分泌的具有多種功能的營養(yǎng)因子,對損傷的神經(jīng)具有營養(yǎng)、促進(jìn)再生及修復(fù)的作用,因而被廣泛應(yīng)用于中樞與外周神經(jīng)修復(fù)。而神經(jīng)生長因子的半衰期短、容易失活,且易被體液稀釋而降低其作用效果,因而如何將神經(jīng)生長因子更有效地固定在材料表面以保持和提高其作用效果是近年來研究的熱點(diǎn)。自然界中海洋貽貝類具有強(qiáng)烈的粘附性,研究者從中受到啟示,發(fā)現(xiàn)其粘附成分主要是3,4-L-二羥基苯丙氨酸(3,4-L-dihydroxyphenylalanine,DOPA),因而以這種具有粘附能力的DOPA結(jié)構(gòu)作為媒介,能將神經(jīng)生長因子NGF更有效地固定于神經(jīng)修復(fù)材料上,對其進(jìn)行改性。本課題首先通過基因工程技術(shù)將酪氨酸重復(fù)序列基因(Tyrosine-Lysine-Tyrosine-LysineTyrosine,YKYKY)整合到NGF基因末端,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的表達(dá),并利用Ni柱親和層析法對目的蛋白NGF-YKYKY進(jìn)行純化,通過酪氨酸羥化反應(yīng)將其中的酪氨酸轉(zhuǎn)化成DOPA結(jié)構(gòu),對所獲得的目的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)與生物活性的檢測。將聚碳酸亞丙酯(Poly(propylene carbonate),PPC)與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)兩種材料復(fù)合,通過溶液置換法,制備了不同原料比的多組神經(jīng)導(dǎo)管支架,利用多種檢測手段篩選出性能最優(yōu)的一組。最后將NGF-DOPA與PPC-PLGA復(fù)合材料結(jié)合,對獲得的改性神經(jīng)導(dǎo)管材料進(jìn)行一系列檢測,并利用大鼠雪旺細(xì)胞對這種改性神經(jīng)導(dǎo)管材料的生物活性進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所構(gòu)建的NGF-YKYKY基因載體可在大腸桿菌中表達(dá),純化和復(fù)性后經(jīng)特異性鑒定確定所獲得的蛋白為目的蛋白,經(jīng)活性鑒定發(fā)現(xiàn)YKYKY和DOPA的引入并不影響NGF的功能區(qū),它們均可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化;我們通過溶液置換法制備了分布均一、柔韌性好可加工成導(dǎo)管、內(nèi)部孔隙率高的PPC-PLGA復(fù)合材料膜,結(jié)果顯示PPC-75PLGA復(fù)合材料膜的抗拉伸力最強(qiáng),斷裂伸長率最大,熱力學(xué)性質(zhì)最好,對細(xì)胞無毒性,有利于細(xì)胞粘附,可促進(jìn)細(xì)胞增殖,因而PPC-75PLGA組復(fù)合材料膜是優(yōu)良的制備神經(jīng)導(dǎo)管支架的材料;最后我們將具有粘附性的NGF-DOPA固定在PPC-75PLGA復(fù)合膜上,通過ELISA、接觸角和XPS等表征,發(fā)現(xiàn)與普通NGF及未經(jīng)羥化的蛋白NGF-YKYKY相比,NGF-DOPA對材料的粘附能力更強(qiáng),此外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,粘附于材料表面的NGF-DOPA具有良好的生物學(xué)功能,可促進(jìn)雪旺細(xì)胞的粘附,調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞分泌一系列神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)因子,為神經(jīng)軸突的再生和重建提供了良好的生理環(huán)境。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08
【圖文】：

第二章 重組神經(jīng)生長因子的構(gòu)建、表達(dá)與純化2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 黏附性神經(jīng)生長因子前體 NGF-YKYKY 基因載體的構(gòu)建我們將擴(kuò)增的單克隆菌落送至上海生工生物公司進(jìn)行序列測試，檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)化結(jié)果，測序結(jié)果如下，我們將測序結(jié)果與 NGF 序列比較，結(jié)果顯示該序列與 NGF 序列相符合，且其中包含 Nde I 和 Xho I 兩個(gè)酶切位點(diǎn)，以及 C’端的 YKYKY 氨基酸序列，說明我們設(shè)計(jì)的NGF-YKYKY 基因序列（pET15b）正確，NGF-YKYKY 與 pET15b 載體的重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，且具有氨芐抗性。

2.2 重組蛋白 NGF-YKYKY 誘導(dǎo)表達(dá)的 SDS-PAGE 電泳分導(dǎo)前全菌蛋白; 2:誘導(dǎo)后全菌蛋白; 3: 菌體裂解后上清;4: 菌 NGF-YKYKY 的純化親和柱對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，將溶解的菌體沉淀（其中含 Ni 柱充分結(jié)合，用洗滌緩沖液 C 和 D 洗滌，除去不與 Ni 目的蛋白NGF-YKYKY洗脫下來，將各部分樣品進(jìn)行15% 鎳離子親和層析法純化后，一少部分目的蛋白因結(jié)合不牢固液 C1 流出，而最終洗脫液 E 的條帶中在大約 14.4 kd 位置為 NGF-YKYKY 單體蛋白，該結(jié)果說明這種 Ni 柱親和層析KY 純化出來，獲得的蛋白純度高，產(chǎn)量大。

且具有氨芐抗性。圖 2.1 重組蛋白 NGF-YKYKY 基因測序圖2.3.2 重組蛋白 NGF-YKYKY 的表達(dá)我們?nèi)〉鞍渍T導(dǎo)表達(dá)前的菌體樣品、誘導(dǎo)后的菌體樣品、裂解后的上清液以及沉淀進(jìn)行15% SDS-PAGE 分析。結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前菌體蛋白相比，誘導(dǎo)后全菌蛋白在約 14.4 kd 處出現(xiàn)明顯單一條帶，1 號與 2 號泳道差異顯著，這一條帶所對應(yīng)的分子量與 NGF 單體理論值一致，說明我們所獲得的含有重組質(zhì)粒的 BL21 大腸桿菌可表達(dá)目的蛋白 NGF-YKYKY，且產(chǎn)量較高。而比較裂解后的上清液以及沉淀的兩條條帶，可見菌體經(jīng)超聲破碎后，少量菌體蛋白以溶解的形式存在于裂解上清中，而目的蛋白主要是以單鏈包涵體的形式存在于沉淀中。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 沈麗;王妍;;神經(jīng)生長因子的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2015年06期

2 施劍明;牛力;杜桂花;殷明;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療周圍神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展[J];中國矯形外科雜志;2014年12期

3 于洋;洪仕君;趙麗萍;李利華;;神經(jīng)生長因子NGF的神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制及臨床應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J];昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年02期

4 徐莉;饒春明;;神經(jīng)生長因子的研究進(jìn)展[J];中國生物制品學(xué)雜志;2014年01期

5 李玢;郝立君;;不同神經(jīng)導(dǎo)管材料的研究進(jìn)展[J];中國美容整形外科雜志;2014年01期

6 葉蘭萍;武元元;曹廣通;;神經(jīng)生長因子促進(jìn)燙傷創(chuàng)面釋放內(nèi)源性生長因子[J];中國組織工程研究;2013年28期

7 張耀丹;王曉明;黃更珍;;周圍神經(jīng)損傷修復(fù)技術(shù)的研究進(jìn)展[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2013年02期

8 宋鵬飛;孫海榮;王榮民;張雪峰;王永霞;;聚碳酸亞丙酯共混改性研究進(jìn)展[J];材料導(dǎo)報(bào);2012年13期

9 湯鋒;王偉;;組織工程修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2009年01期

10 周慶海;高鳳翔;盧會敏;王獻(xiàn)紅;趙曉江;王佛松;;聚碳酸1,2-丙二酯/蒙脫土復(fù)合材料的制備與性能[J];高分子學(xué)報(bào);2008年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王妍;重組人神經(jīng)生長因子的克隆、表達(dá)、純化、性質(zhì)和其應(yīng)用的研究[D];吉林大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 吳乃蓬;重組人膠原綁定骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在大腸桿菌中的表達(dá)、純化與復(fù)性[D];吉林大學(xué);2016年

2 李紅媛;纖維素增強(qiáng)PPC/CaCO_3復(fù)合材料及其降解性研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2013年

3 劉慧宏;聚碳酸亞丙酯的共混改性研究及復(fù)合薄膜材料的研制[D];海南大學(xué);2010年

4 張海濤;苯乙烯型熱塑性彈性體增韌改性聚碳酸酯的研究[D];四川大學(xué);2006年

本文編號：2748032