【摘要】：目的:本研究的目的是在現(xiàn)有醫(yī)用鈷基合金材料中加入銅元素,使用3D打印工藝中的選擇性激光熔融技術(shù)(selected laser melting,SLM)制得一種新型含銅鈷基合金并探究其生物相容性以及其生物功能化作用。材料與方法:以3D打印技術(shù)制得的兩種新型含銅鈷基合金(混粉含銅鈷基合金,合金粉含銅鈷基合金)作為實驗組,以3D打印技術(shù)制得的不含銅元素的常規(guī)醫(yī)用鈷基合金作為對照組。將實驗材料與人牙周膜成纖維細(xì)胞(Periodontalliga-ment fibroblast,PDLF)小鼠胚胎成骨細(xì)胞(Mouse pre-osteoblastic cells,MC3T3-E1)以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)分別與材料進(jìn)行共培養(yǎng)后,使用細(xì)胞增殖活力測定(CCK-8法)、實時無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)(Real time cellular analysis,RTCA)、細(xì)胞毒性測定實驗、鬼筆環(huán)肽細(xì)胞染色實驗、細(xì)胞流式實驗來檢測材料對細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附的影響,評價新型含銅鈷基合金的生物相容性。使用HUVEC細(xì)胞進(jìn)行Transwell遷移實驗,細(xì)胞成小管實驗以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)測定相關(guān)促血管化基因表達(dá)來檢測材料對細(xì)胞遷移的影響,評價新型含銅鈷基合金的促血管化能力。使用MC3T3-E1細(xì)胞與材料共培養(yǎng)后進(jìn)行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性檢測實驗,茜素紅染色實驗以及使用PCR技術(shù)測定相關(guān)促成骨基因表達(dá)情況,評價其促成骨能力。最終綜合評定新型含銅鈷基合金的生物相容性以及生物功能作用。結(jié)果1.CCK-8試驗結(jié)果表明,新型3D打印含銅鈷基合金材料與PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1細(xì)胞分別進(jìn)行共培養(yǎng)1、3、7天后其細(xì)胞增殖率均大于75%,屬于1級細(xì)胞毒性。2.RTCA實驗結(jié)果表明,使用新型3D打印含銅鈷基合金浸提培養(yǎng)液分別培養(yǎng)PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1細(xì)胞120小時后,三種細(xì)胞均生長良好,細(xì)胞生長曲線沒有發(fā)生阻滯或下降等狀況,實驗組與對照組生長曲線基本一致。3.細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果表明,將新型3D打印含銅鈷基合金材料與PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1細(xì)胞分別進(jìn)行共培養(yǎng)1、3天后,實驗組與對照組細(xì)胞凋亡率無顯著性差異。4.使用鬼筆環(huán)肽對黏附在新型3D打印含銅鈷基合金材料上4小時及24小時的PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1細(xì)胞染色后,我們可以在顯微鏡下觀察到各組細(xì)胞在各個時間點上細(xì)胞生長及鋪展情況彼此相似,未見顯著性差異。5.Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,兩個實驗組細(xì)胞遷移數(shù)量均高于對照組細(xì)胞遷移數(shù)量,但實驗組與對照組間不存在顯著性差異(P0.05)。6.成小管實驗結(jié)果顯示,實驗組在形成的小管數(shù)量及長度上均顯著高于對照組(P0.05)。7.PCR測定成小管相關(guān)基因表達(dá)情況的實驗結(jié)果表明,相較于對照組,實驗組細(xì)胞相關(guān)成小管基因表達(dá)情況明顯高于對照組(P0.05)。8.ALP活性檢測結(jié)果表明,合金粉含銅鈷基合金組與對照組常規(guī)醫(yī)用鈷基合金共培養(yǎng)的細(xì)胞在ALP活性上并無顯著性差異,但合金粉含銅鈷基合金組ALP活性明顯高于混粉含銅鈷基合金組。9.茜素紅染色實驗表明,合金粉含銅鈷基合金組其鈣結(jié)節(jié)生成量略高于對照組及混粉含銅鈷基合金組,但不具有顯著性差異(P0.05)。10.PCR測定促成骨相關(guān)基因表達(dá)情況的實驗結(jié)果表明,合金粉含銅鈷基合金的促成骨相關(guān)基因表達(dá)情況顯著高于混粉含銅鈷基合金實驗組(P0.05),但是合金粉含銅鈷基合金實驗組與對照組常規(guī)醫(yī)用含銅鈷基合金的促成骨相關(guān)基因表達(dá)情況不存在顯著性差異(P0.05)。結(jié)論1.新型3D打印含銅鈷基合金材料相較于常規(guī)應(yīng)用的醫(yī)用鈷基合金材料對PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1細(xì)胞無任何明顯細(xì)胞毒性,所有檢測指標(biāo)均滿足生物醫(yī)用材料使用標(biāo)準(zhǔn)。2.相較于常規(guī)使用的醫(yī)用鈷基合金,含銅鈷基合金具有顯著的促血管化作用。3.相較于常規(guī)使用的醫(yī)用鈷基合金,含銅鈷基合金的促成骨作用并不明顯,但是合金粉含銅鈷基合金促成骨效果明顯好于混粉含銅鈷基合金。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R783.1
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果LF 細(xì)胞的生物相容性實驗結(jié)果1. CCK-8 細(xì)胞增殖活力測定結(jié)果 1分別為 PDLF細(xì)胞與不同材料共培養(yǎng)1、3和7天后的 OD值。由料隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，OD 值逐漸增大，說明細(xì)胞增殖良好。兩材料的 OD 值和陰性對照組相比幾乎無差別，不存在顯著性差異。金材料之間也不存在顯著性差異。如表 3所示，兩種含銅鈷基合金率（RGR 值）均＞99%，其結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 75%的 1 級細(xì)胞毒性要求毒性，說明相對于常規(guī)使用的醫(yī)用鈷基合金材料，新型醫(yī)用含銅具有細(xì)胞毒性。滿足植入材料對細(xì)胞毒性的要求。

3.1.2. RTCA 實時監(jiān)測曲線的比較圖 2為 PDLF細(xì)胞使用不同材料浸提液培養(yǎng) 140小時后的 Cell Index（CI）值曲線。從接種期時段（最初將 PDLF 接種到 E-Plate 的 24 小時）的各個細(xì)胞曲線來看，各孔的細(xì)胞生長良好，體現(xiàn)在細(xì)胞曲線隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞曲線不斷上升，無明顯停滯和下降的情況發(fā)生，各組間無明顯差異。生長增殖時段（浸提液培養(yǎng)階段，24H開始直到結(jié)束）內(nèi)細(xì)胞的培養(yǎng)液換成相應(yīng)材料的浸提液，換液后我們可以看到各孔的細(xì)胞仍然生長良好，體現(xiàn)在細(xì)胞曲線仍然隨著培養(yǎng)時間的延長，且細(xì)胞曲線不斷上升，各組間無明顯停滯和下降的情況發(fā)生，各組間也無明顯差異。這就表明直到試驗結(jié)束的整個培養(yǎng)過程中各組 PDLF 細(xì)胞均生長狀況良好。三組材料間無顯著差異，說明本材料浸提液中的成分在整個細(xì)胞生長繁殖過程中不會抑制細(xì)胞增殖或?qū)?xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

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本文編號：2723183