【摘要】：目的:Scleraxis修飾的hAMSCs能否與人脫細(xì)胞羊膜支架(HAAM)復(fù)合,并在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證Scx-hAMSCs-HAAM復(fù)合體的生物相容性及免疫原性。方法:1)取人足月剖宮產(chǎn)胎盤(pán)的羊膜組織,分別利用酶消法、凍融法制備人脫細(xì)胞羊膜支架(HAAM),將兩種方法制備好的HAAM進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片行HE染色后于倒置顯微鏡下觀察,比較不同方法制備HAAM的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),評(píng)估兩種方法脫細(xì)胞的效果。通過(guò)免疫熒光染色,將HAAM置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞移除的情況及經(jīng)脫細(xì)胞處理后人羊膜表面細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)丟失的情況。2)同上方法獲取人羊膜,經(jīng)胰酶和膠原酶消化分離得到hAMSCs,純化、培養(yǎng)、傳代,倒置顯微鏡觀察鏡下hAMSCs生長(zhǎng)及排列的情況,至P3代運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)hAMSCs行表型鑒定,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。構(gòu)建Scx慢病毒載體,通過(guò)293T細(xì)胞對(duì)病毒進(jìn)行擴(kuò)增及滴度測(cè)定。選取合適滴度轉(zhuǎn)染P3代hAMSCs獲得Scx-hAMSCs,利用PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)Scx基因經(jīng)轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性。3)將Scx-hAMSCs與HAAM共培養(yǎng),在培養(yǎng)14d時(shí)對(duì)Scx-hAMSCs細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞染色檢測(cè)其在HAAM上的生長(zhǎng)分布情況,并分別于倒置相差顯微鏡、掃描電鏡(SEM)下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。然后設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組三個(gè)分組,將已經(jīng)制備的HAAM-Scx-hAMSCs置入SD大鼠背部筋膜下,觀察一周后處死SD大鼠,取術(shù)區(qū)組織做HE染色,石蠟包埋、切片,鏡下觀察各組的免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果:1)制備人脫細(xì)胞羊膜支架(HAAM)酶消法脫細(xì)胞效果比凍融法好,經(jīng)酶消法脫細(xì)胞后HAAM經(jīng)HE染色可見(jiàn)組織表面光滑,已無(wú)法看到任何細(xì)胞結(jié)構(gòu),經(jīng)免疫熒光染色,可見(jiàn)經(jīng)酶消法處理后的HAAM細(xì)胞表達(dá)為陰性,且較脫細(xì)胞前的人羊膜(HAM)膠原無(wú)明顯減少。2)采用胰酶+膠原酶消化HAM可獲得大量穩(wěn)定增殖的hAMSCs,經(jīng)純化、培養(yǎng)、傳代后細(xì)胞形態(tài)逐漸呈紡梭形、細(xì)胞排列逐漸致密并呈現(xiàn)出螺旋式生長(zhǎng),流式細(xì)胞術(shù)鑒定P3代hAMSCs后提示間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73(92.1%)、CD105(84.8%)、CD90(94.7%)、CD44(94.1%)高表達(dá),CD19+CD34+CD11b+CD45+HLA-DR(0.3%)呈陰性表達(dá)。酶切產(chǎn)物PCR檢測(cè)在600bp位置顯示條帶大小,設(shè)置不同梯度對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,篩選出2×108TU/μL病毒原液,以6μL病毒原液轉(zhuǎn)染P3代hAMSCs,分別于24h、48h后熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞中大量熒光表達(dá),提示轉(zhuǎn)染效果良好,PCR檢測(cè)Scx-hAMSCs轉(zhuǎn)染組Scx基因表達(dá)量高于未轉(zhuǎn)染組(*P0.05)。3)將上步驟中制備的Scx-hAMSCs與HAAM進(jìn)行細(xì)胞-支架復(fù)合,培養(yǎng)14天后進(jìn)行免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察經(jīng)種植后Scx-hAMSCs已經(jīng)覆蓋HAAM,呈桿形或者紡錘形。HE染色可見(jiàn)相較于陰性對(duì)照組,置入Scx-hAMSCs-HAAM(實(shí)驗(yàn)組)局部術(shù)后1周后術(shù)區(qū)存在炎癥反應(yīng),可見(jiàn)漿細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),組織局部可見(jiàn)肉芽組織、新生毛細(xì)血管生長(zhǎng),壞死和瘢痕修復(fù)并存,炎癥反應(yīng)較陰性對(duì)照組重;術(shù)后1個(gè)月,陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組,在鏡下呈現(xiàn)出炎癥消退,實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)淡粉色疏松的類(lèi)似于羊膜的被覆上皮組織包繞局部組織,且已出現(xiàn)細(xì)胞貼附生長(zhǎng),表層細(xì)胞呈線性緊密排列,可認(rèn)為細(xì)胞-支架復(fù)合體植入SD大鼠體內(nèi)后免疫原性較低。結(jié)論:1)利用酶消法處理人羊膜可以獲得具有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)和良好孔隙率的人脫細(xì)胞羊膜支架(HAAM),可作為生物支架為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供條件。2)Scx-hAMSCs-HAAM與HAAM在動(dòng)物體中短期時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出低免疫原性,有助于組織工程韌帶的構(gòu)建,為其提供了潛在的移植物來(lái)源。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08
【圖文】：

具有一定的韌性和機(jī)械強(qiáng)度。經(jīng)酶消法處理后，圖2B�？梢�(jiàn)經(jīng)過(guò)胰酶消化后獲得的 HAAM，結(jié)構(gòu)變得更加通透，相較于 HAM 變得更薄、容易撕碎，這與間充質(zhì)細(xì)胞的移除和膠原的流失有關(guān)系。經(jīng)凍融法處理后。見(jiàn)圖2C，可見(jiàn)人羊膜表面變得僵硬，部分發(fā)生皸裂。圖 2 肉眼觀下人羊膜與分別通過(guò)酶消法和凍融法獲得的脫細(xì)胞羊膜Fig.2 Human amniotic membrane under naked eyes and acellular amniotic membrane obtained byenzyme digestion and freeze-thaw respectively.Note:A: Human amniotic membrane;B：Treatment of human amniotic membrane by enzymeelimination；C：Treatment of human amnion by freeze-thaw method.2.2.1 倒置相差顯微鏡下觀察 HAM 與 HAAM 組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化采用 HE 染色人新鮮羊膜，見(jiàn)圖 3A。倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)人新鮮羊膜中大量上皮細(xì)胞呈現(xiàn)串珠狀排列于羊膜基底膜表面，其細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)圓形或者類(lèi)圓形，核深染色為紫色；上層深面基底膜結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)為深粉色；皮下結(jié)締組織疏松并可見(jiàn)少量細(xì)胞（hAMSCs）分布其中，細(xì)胞核深染呈紫色。經(jīng)酶消法處理后，見(jiàn)圖 3B�？梢�(jiàn)經(jīng)過(guò)酶消化后羊膜表面及基底層細(xì)胞已經(jīng)全部被移除，結(jié)締組織排列紊亂，但總體結(jié)構(gòu)仍保持良好。經(jīng)凍融法處理后，見(jiàn)圖 3C

圖 3 倒置顯微鏡下觀察 HAM 及分別運(yùn)用酶消法和凍融法制備的 HAAM 組織結(jié)構(gòu)（HE 染色40×）Fig.3 Observation of HAM under inverted microscope and tissue structure of HAAM prepared byenzyme digestion and freeze-thaw method (HE staining 40 ×).Note:A: Human amniotic membrane of HE stain;B: HE staining of human amniotic membranetreated by enzyme elimination method;C: HE staining of human amniotic membrane after freeze-thaw treatment.2.2.2 熒光顯微鏡下觀察 HAM 與 HAAM 組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化通過(guò)對(duì) HAM 與 HAAM 進(jìn)行免疫熒光染色（見(jiàn)圖 4A、4B），未脫細(xì)胞的 HAM 上Collagen Type I 和細(xì)胞核 DAPI 染色成陽(yáng)性表達(dá)，而在經(jīng)過(guò)酶消法脫細(xì)胞后，見(jiàn)圖4C、4D，制備的 HAAM 上 DAPI 染色結(jié)果為陰性，提示 HAAM 上細(xì)胞已基本移除，Collagen Type I 表達(dá)較 HAM 弱，可能與酶消法引起人羊膜膠原丟失有關(guān)。

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本文編號(hào)：2723854