發(fā)布時間：2020-06-10 02:22

【摘要】：目的:心肌梗死、慢性心血管疾病等造成的心肌損傷會導(dǎo)致纖維性瘢痕組織形成,影響心臟的搏動及泵血功能。構(gòu)建以種子細(xì)胞和生物材料為基礎(chǔ)的工程化心肌組織有望為受損心肌的修復(fù)提供重要的候選方法;此外,工程化心肌組織也可為藥物心臟毒性的評價提供體外快速篩選途徑。支架材料能為細(xì)胞提供合適的人造細(xì)胞外基質(zhì)、力學(xué)以及電學(xué)微環(huán)境,促進(jìn)心肌細(xì)胞分化和成熟,在工程化心肌組織構(gòu)建中具有關(guān)鍵作用。天然心肌是電活性組織,其中分布著具有電傳導(dǎo)功能的浦肯野纖維。源自竇房結(jié)的電信號通過心肌時,通過“興奮-收縮”耦聯(lián)作用誘發(fā)心肌細(xì)胞同步收縮。與此同時,心肌組織還具有優(yōu)良的力學(xué)強(qiáng)度,能夠支持心臟搏動時持續(xù)的收縮和舒張。因此,用于工程化心肌組織構(gòu)建的支架材料應(yīng)同時具有優(yōu)良的導(dǎo)電性和彈性模量。水凝膠材料能吸收并保持大量水分,利于細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸,理化性質(zhì)可調(diào)控,在心肌組織工程中得到大量的研究。但單一成分的水凝膠通常為電絕緣材料,不利于細(xì)胞間電信號的傳遞;此外,水凝膠的模量通常比較低,在支持心肌細(xì)胞收縮方面尚不理想。本課題模擬天然心肌組織中浦肯野纖維的分布和電傳導(dǎo)功能,以高電導(dǎo)率和高模量的碳纖維(CF)與生物相容性良好的聚乙烯醇(PVA)復(fù)合,利用CF的特性提高PVA水凝膠的導(dǎo)電性和力學(xué)性能,構(gòu)建碳纖維增強(qiáng)聚乙烯醇導(dǎo)電水凝膠(PVA/CFs),系統(tǒng)研究PVA/CFs對心肌細(xì)胞增殖、成熟及電生理功能的作用,以及心肌細(xì)胞-水凝膠復(fù)合體(NRCM@PVA/CFs)對藥物的響應(yīng),研究PVA/CFs對血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附連接和巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的作用,為心肌缺損修復(fù)及心血管系統(tǒng)藥物的體外篩選提供新材料和新方法。方法:應(yīng)用反復(fù)冷凍-融化方法制備碳纖維含量不同的碳纖維增強(qiáng)聚乙烯醇導(dǎo)電水凝膠(PVA/CFs);通過掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu),用四探針測試法測定直流電導(dǎo)率,用電子萬能試驗機(jī)檢測材料彈性模量,采用重量法測定平衡溶脹比及降解行為。通過CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)檢測大鼠原代心肌細(xì)胞(Neonatal Rat Cardiomyocytes,NRCMs)、大鼠心肌細(xì)胞系(H9c2)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)、小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)在 PVA/CFs上的生長、增殖規(guī)律,使用LIVE/DEAD試劑檢測NRCMs的細(xì)胞活率。通過免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning Confocal Microscopy)觀察NRCMs、H9c2和HUVEC的生長形態(tài)、心肌成熟相關(guān)蛋白α-actinin、cTnT、Cx43的表達(dá),以及HUVEC細(xì)胞鈣黏蛋白VE-Cadherin的表達(dá)。通過Western Blot進(jìn)一步半定量分析與細(xì)胞功能相關(guān)蛋白α-actinin、cTnT、Cx43、VE-Cadherin的表達(dá),并研究了碳纖維對NRCMs細(xì)胞α5β1-integrin/ILK/p-AKT力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。使用鈣離子熒光探針Fluo 4-AM及活細(xì)胞高速激光共聚焦實時成像分析系統(tǒng)檢測NRCMs細(xì)胞在自發(fā)搏動過程中及化療藥物阿霉素和心率調(diào)節(jié)藥物異丙腎上腺素處理前后鈣離子濃度的動態(tài)變化。應(yīng)用Real Time PCR方法檢測RAW264.7炎性反應(yīng)相關(guān)基因TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表達(dá),通過 ELISA 試劑盒檢測 RAW264.7 分泌 TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞因子的水平。結(jié)果:(1)通過反復(fù)冷凍-融化方法制備了碳纖維增強(qiáng)聚乙烯醇導(dǎo)電水凝膠(PVA/CFs),碳纖維均勻分布在聚乙烯醇水凝膠內(nèi),凝膠表面形成近似天然細(xì)胞外基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的均勻貫通微孔結(jié)構(gòu),PVA/CFs具有利于心肌細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)和氧的擴(kuò)散的高溶脹比;其電導(dǎo)率在0.1-0.4S/m之間,顯著高于PVA,并與心肌組織的電導(dǎo)率(0.03-0.6 S/m)接近;其彈性模量與天然心臟收縮時相近。(2)PVA/CFs支持大鼠原代心肌細(xì)胞NRCMs、大鼠心肌細(xì)胞系H9c2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的正常生長和增殖;可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞骨架蛋白的組裝和取向分布,促進(jìn)心肌細(xì)胞向成熟表型分化;有利于HUVEC形成典型的“鵝卵石樣”內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和表達(dá)細(xì)胞間粘附蛋白VE-Cadherin;不改變RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表達(dá)水平及相應(yīng)蛋白的分泌水平。(3)PVA/CFs能夠顯著上調(diào)三種與心肌細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白Cx43、α-actinin和cTnT的表達(dá),有利于增強(qiáng)原代心肌細(xì)胞NRCMs的自發(fā)搏動能力;在PVA/CFs水凝膠上生長的NRCMs表現(xiàn)出更為規(guī)律、同步、增強(qiáng)的搏動行為。所構(gòu)建的細(xì)胞-水凝膠復(fù)合體(NRCM@PVA/CFs)暴露于心臟毒性藥物阿霉素時,與NRCM@PVA相比,可以在更長的時間內(nèi)保持有效的搏動;當(dāng)暴露于加快心率藥物異丙腎上腺素時,可快速響應(yīng)藥物的作用而改變搏動速率。(4)機(jī)理研究結(jié)果表明,CFs激活了 α5β1整合素介導(dǎo)的α5β1-integrin/ILK/P-AKT力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并上調(diào)了 Rho家族小GTP酶RhoA、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)。結(jié)論:碳纖維增強(qiáng)聚乙烯醇導(dǎo)電水凝膠PVA/CFs通過激活α5β1整合素介導(dǎo)的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和上調(diào)RhoA、HIF-1α,顯著增強(qiáng)原代大鼠心肌細(xì)胞的體外成熟及電生理功能;與傳統(tǒng)培養(yǎng)的細(xì)胞相比,所構(gòu)建的原代心肌細(xì)胞-導(dǎo)電水凝膠復(fù)合體(NRCM@PVA/CFs)對心臟毒性藥物和加快心率藥物具有更為優(yōu)異的響應(yīng)功能。此外,PVA/CFs支持原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞的生長,利于細(xì)胞間形成完整的內(nèi)皮連接,同時不會引起巨噬細(xì)胞明顯的炎性反應(yīng)。
【圖文】：

管和由成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)包圍【３】，縫隙連接（Ｇａｐ邋ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ，ＧＪ）是逡逑閏盤上的主要連接結(jié)構(gòu)，與橋粒（Ｄｅｓｍｏｓｏｍｅ）和黏合連接（Ａｄｈｅｒｅｎｓ邋ｊｕｎｃｔｉｏｎ，逡逑ＡＪ）共同作用，將心臟中相鄰的心肌細(xì)胞連在一起（圖１－１），保證電信號的快速傳逡逑遞，誘發(fā)心臟的同步收縮【４】�？p隙連接介導(dǎo)相鄰細(xì)胞之間的直接通信，作為細(xì)胞逡逑間通道連接相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，允許各種化合物（如代謝產(chǎn)物、水、離子以及最大逡逑分子量１０００Ｄａ的分子）被動擴(kuò)散，是細(xì)胞之間電信號及代謝交換的重要通道�？p逡逑隙連接通道由１２個連接蛋白組成，每個細(xì)胞貢獻(xiàn)６個，如圖１－２所示，６個連接蛋逡逑白在質(zhì)膜中形成半通道，稱為連接子。當(dāng)兩個細(xì)胞膜上的連接子相互靠攏，形成間逡逑距約為３．５邋ｎｍ的細(xì)胞縫隙時即形成了所謂的縫隙連接【５】。連接蛋白家族包括非常逡逑多的高度相關(guān)但功能不同的連接蛋白。在心室心肌中，最重要的連接蛋白亞型是縫逡逑隙連接蛋白４３邋（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ－４３，Ｃｘ４３），它是構(gòu)成心肌縫隙連接通道的主要連接蛋白，逡逑對細(xì)胞間電耦合和心肌組織功能的重建至關(guān)重要【６

心內(nèi)膜下部并形成浦肯野纖維網(wǎng)絡(luò)【８】。逡逑心肌細(xì)胞興奮－收縮壀聯(lián)（ｅｘｃｉａｔｉｏｎ－ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ，邋ＥＣＣ）過程逡逑細(xì)胞間的興奮－收縮耦聯(lián)依賴于Ｃａ２＋從胞內(nèi)鈣庫的進(jìn)出，具體過程如圖１－４所示，逡逑當(dāng)動作電位發(fā)生時，細(xì)胞膜去極化后打開Ｌ型Ｃａ２＋通道，通道開放的瞬間少量的逡逑Ｃａ２＋通過Ｌ型Ｃａ２＋通道流入細(xì)胞，通過這種機(jī)制進(jìn)入的少量Ｃａ２＋通過雷諾丁受體激逡逑活肌漿網(wǎng)中鈣誘導(dǎo)的鈣釋放正反饋過程，使得肌漿網(wǎng)釋放大量的Ｃａ２＋到細(xì)胞漿，Ｃａ２＋逡逑與肌鈣蛋白結(jié)合，使肌動蛋白上的肌球蛋白結(jié)合位點(diǎn)開放，肌絲收縮。隨后通過鈣逡逑泵快速將Ｃａ２＋回收進(jìn)入肌質(zhì)網(wǎng)，，同時Ｎａ－Ｃａ交換將通過Ｌ型Ｃａ２＋通道進(jìn)入的少量逡逑Ｃａ２＋泵出細(xì)胞外，使胞質(zhì)升高的游離Ｃａ２＋水平恢復(fù)到ｌＯＯｎＭ范圍，心肌舒張【１０】。逡逑１２逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08;R542.22

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本文編號：2705632