【摘要】：研究目的:1.在無菌條件下制備載有不同VEGF濃度的海藻酸鹽/殼聚糖微球型支架。2.在體外分離培養(yǎng)HPMSCs。3.探究負(fù)載不同VEGF濃度的海藻酸鹽/殼聚糖微球型支架對HPMSCs增殖和成骨活性的影響,探討出促進(jìn)HPMSCs增殖與成骨活性的最佳VEGF濃度,并且在此濃度下,來檢測細(xì)胞與支架材料的黏附率。研究方法1.利用層層自組裝和陰陽離子靜電復(fù)合原理,制備載有VEGF和萬古霉素的多層緩釋微球型支架,并且對其中VEGF設(shè)置濃度梯度如下:無支架空白組;Ong/ml;10ng/ml;25ng/ml;50ng/ml。2.采用組織塊培養(yǎng)法,從胎盤中分離培養(yǎng)出原代HPMSCs,利用三代以后的細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化和成脂誘導(dǎo)分化以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.通過MTT法檢測不同濃度VEGF的微球型支架對HPMSCs的增殖活性的影響,通過成骨誘導(dǎo)茜素紅染色、ALP染色、ALP活力測定和Western blot檢測ALP和BMP-2基因表達(dá)情況來評價(jià)不同濃度VEGF的微球型支架對HPMSCs的成骨活性的影響。結(jié)果:1.無菌環(huán)境下制備的不同濃度VEGF的多層緩釋微球支架兼具緩釋和支架功能,形態(tài)良好。2.從胎盤組織中成功分離培養(yǎng)出長梭形的人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后可見鈣結(jié)節(jié),成脂誘導(dǎo)后可見脂滴。3.支架材料中負(fù)載的高濃度的VEGF可以促進(jìn)HPMSCs的增殖(P0.05),支架材料中負(fù)載的VEGF可以促進(jìn)HPMSCs的成骨分化,并且有劑量依賴性,當(dāng)VEGF 50ng/ml時(shí),細(xì)胞表現(xiàn)出最佳的增殖和成骨活性。結(jié)論:1.成功制備載有不同VEGF濃度的多層緩釋微球型支架,并且驗(yàn)證其無菌。2.成功從胎盤組織中提取出HPMSCs,成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)鑒定其符合干細(xì)胞特征。3.通過支架材料與HPMSCs的共培養(yǎng),探討出了促進(jìn)HPMSCs增殖與成骨活性的最佳VEGF濃度為50ng/ml。4.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了以HPMSCs為種子細(xì)胞,以海藻酸鈉/殼聚糖微球型支架為支架材料,以VEGF為細(xì)胞因子,萬古霉素為抗炎藥物的組織工程骨,為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

２．４結(jié)果逡逑２．４．１多層緩釋微球的形態(tài)逡逑光鏡下微球大小均勻，光滑完整，直徑９００－ＨＸＫＨｉｍ，見圖２．３Ａ；掃描電子逡逑顯微鏡下可見微球大致呈球形，表面完整，有許多褶皺，，見圖２．３Ｂ：肉眼觀察逡逑制得的微球大小均勻，直徑約１ｍｍ，晶瑩剔透，見圖２．３Ｃ和圖２．３Ｄ。用２０ｍｌ邋４％逡逑（ｗ／ｖ）邋ＳＡ溶液制備一次多層緩釋微球大約可得到９００顆球，０．１ｍｌ的微球大約逡逑為５０顆。逡逑0邋■逡逑圖２．３微球的形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２．３邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ逡逑（Ａ：光鏡下的微球；Ｂ：電鏡下的微球；Ｇ：微球肉眼觀；Ｄ：微球肉眼觀。）逡逑１０逡逑

逑２．４．２無菌性驗(yàn)證逡逑第２４ｈ、７２ｈ微球周圍均未見菌落，見圖２．４；逡逑■邐（；邋ｎ逡逑／？．４邋

本文編號(hào)：2655843