發(fā)布時(shí)間：2020-05-09 05:59

【摘要】：臨床上多種骨科疾患需要骨移植替代物行植骨融合和骨結(jié)構(gòu)修復(fù)重建,如創(chuàng)傷、腫瘤、骨折不愈合、骨組織發(fā)育不良、脊柱融合手術(shù)等等。骨結(jié)構(gòu)修復(fù)重建是改善骨缺損患者日常生活質(zhì)量、使其重新投入社會(huì)勞動(dòng)的唯一有效方法,因此骨替代物的研究對(duì)社會(huì)發(fā)展具有極其重要的意義,也是骨組織工程的終極目標(biāo)。目前已有數(shù)十種復(fù)合骨移植替代產(chǎn)品獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療,這些產(chǎn)品雖然具有良好的生物相容性,能一定程度上誘導(dǎo)成骨分化,但難以同時(shí)滿足與宿主骨組織相匹配的機(jī)械性能和供成骨細(xì)胞滲透生長(zhǎng)的合理三維孔隙結(jié)構(gòu),尤其在治療大段骨缺損時(shí),現(xiàn)有的骨移植替代物產(chǎn)品難以達(dá)到臨床骨組織重建要求。鑒于天然骨組織特殊的生理微觀結(jié)構(gòu),理想的骨替代產(chǎn)品應(yīng)具備以下條件:(1)與宿主骨組織相匹配的機(jī)械強(qiáng)度;(2)恰當(dāng)?shù)目紫堵屎涂紫督Y(jié)構(gòu);(3)利于細(xì)胞粘附、分化和增殖的表面結(jié)構(gòu);(4)良好的生物相容性以及與骨組織生長(zhǎng)相適應(yīng)的可控降解率。由此可見,當(dāng)前的眾多產(chǎn)品還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想骨替代物的標(biāo)準(zhǔn)。如何改進(jìn)骨替代原材料模擬構(gòu)建骨組織結(jié)構(gòu)技術(shù),顯得尤為重要。近年來,3D打印技術(shù)用于骨缺損的修復(fù)重建已成為一種新的熱點(diǎn)及趨勢(shì),但單純的3D打印支架成骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)性能均欠佳,支架表面需要用一些具有骨誘導(dǎo)或成骨作用生物活性材料做修飾,才能改善其性能。目前用于表面修飾的材料主要是生物活性玻璃,生物陶瓷及納米羥基磷灰石等,但上述材料成分均為無機(jī)物,且成骨誘導(dǎo)性能較差,表面修飾物中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)雖然能改善支架成骨誘導(dǎo)功能,但其確實(shí)效果有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考證。脫鈣骨基質(zhì)(DBM)主要由93%的膠原(傳導(dǎo)成骨表面活性物質(zhì))、5%的可溶性蛋白(誘導(dǎo)成骨的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等協(xié)同蛋白)以及2%的殘余礦化基質(zhì),是具有良好的誘導(dǎo)成骨、傳導(dǎo)成骨特性的商業(yè)化生物材料。它以單獨(dú)或聯(lián)合其他材料的方式廣泛用于骨折、骨不連、骨腫瘤、骨融合、股骨頭壞死等手術(shù)。但是DBM缺少骨礦物質(zhì),因機(jī)械強(qiáng)度較差而難以成為理想的骨移植替代物。但若將DBM經(jīng)過一定的物理方法進(jìn)行顆粒尺度上的改變,而后作為3D打印支架的表面修飾,這有可能使支架在獲得穩(wěn)定機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí),增加支架的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)能力。將材料納米化并應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)成為近年來骨組織工程的研究熱點(diǎn)。其研究方向主要集中于礦化機(jī)理、改善支架骨誘導(dǎo)性能、組織修復(fù)、藥物載體、細(xì)胞載體及基因載體等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這一領(lǐng)域已取得了良好的進(jìn)展。但眾多骨移植材料中鮮有關(guān)于納米同種(異體)脫鈣骨基質(zhì)(nDBM)的研究報(bào)道。納米材料具有特殊的比表面積效應(yīng),它極易與外來原子吸附鍵結(jié)合,表現(xiàn)的特性不同于它在整體狀態(tài)時(shí)的性質(zhì)。研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞對(duì)納米尺度材料極其敏感,在60-150nm時(shí)尤為明顯,納米顆粒及粗糙的納米凹槽結(jié)構(gòu)可有效增加絲狀偽足的感知能力,促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散及粘附,使其在納米纖維構(gòu)成的三維微環(huán)境快速增殖。為此,本課首先通過改良Urist法制備凍干脫鈣骨基質(zhì),運(yùn)用二次低溫物理研磨法將DBM研磨至納米級(jí)別,電鏡檢測(cè)其粒徑尺度并對(duì)其生物安全性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。隨后將實(shí)驗(yàn)組前期制備的PCL-TCP 3D打印支架進(jìn)行nDBM表面修飾,并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物骨缺損模型填充等實(shí)驗(yàn),對(duì)其生物相容性及體內(nèi)骨缺損修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)估。通過以上努力,發(fā)展具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高生物安全性骨修復(fù)用生物材料的制備新方法,并為該種新型骨組織工程支架的進(jìn)一步的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)第一部分:nDBM的制備及性能檢測(cè)目的:旨在通過物理研磨法將塊狀DBM處理至納米級(jí),并對(duì)研磨效果及材料的生物安全性進(jìn)行檢測(cè)方法:采用低溫研磨法,先將DBM初步研磨至微米級(jí)別顆粒,再通過高能球磨機(jī)進(jìn)行納米尺度研磨,掃描電鏡觀測(cè)研磨效果及材料形貌。而后按醫(yī)用生物植入材料安全標(biāo)準(zhǔn)ISO10993(GB/T16886)對(duì)nDBM行急性毒性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、致敏試驗(yàn)及細(xì)胞毒性試驗(yàn),評(píng)價(jià)材料的生物安全性。結(jié)果:經(jīng)二次低溫物理研磨后,所制得的nDBM底層致密,呈纖維狀相互連接,纖維粗細(xì)不等,直徑約40-80nm,表面充滿不規(guī)則納米顆粒,顆粒直徑20nm-50nm左右,納米顆粒相互團(tuán)聚,表面密布納米級(jí)別凹槽,納米纖維結(jié)構(gòu)間相互連接,內(nèi)部形成大量相互連通的微米級(jí)別孔隙,其微觀結(jié)構(gòu)符合納米生物材料范疇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,nDBM不引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物急性毒性反應(yīng),溶血率復(fù)合生物材料安全性要求,無致敏現(xiàn)象發(fā)生,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖良好。因此,nDBM具有良好的生物相容性,可用于體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)。結(jié)論:低溫物理研磨法能成功將DBM納米化,材料的生物安全性指標(biāo)符合醫(yī)用植入材料安全標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)第二部分:nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架的構(gòu)建及生物學(xué)性能檢測(cè)目的:將nDBM修飾于PCL-TCP 3D打印支架表面,并對(duì)各組材料的生物相容性及成骨誘導(dǎo)性進(jìn)行檢測(cè)。方法:采用浸泡凍干法將nDBM均勻負(fù)載于支架表面,通過掃描電鏡觀察復(fù)合支架構(gòu)建效果,而后進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),CCK-8法檢驗(yàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況,實(shí)時(shí)熒光PCR、Westen bolt檢測(cè)材料成骨誘導(dǎo)相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),并對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果:采用75%的乙醇作為溶劑,按nDBM與稀釋劑1:5的比例浸泡后的支架,經(jīng)凍干后,可使支架各纖維表面均勻覆蓋nDBM顆粒,電鏡掃描觀察發(fā)現(xiàn),nDBM與支架粘附良好,底層致密,表面布滿大小不一的nDBM顆粒,納米顆粒部分團(tuán)聚,表面布滿納米級(jí)別凹槽,成功構(gòu)建了一種新型的nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架。通過CCK-8檢測(cè)BMSCs的增殖情況,通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在nDBM修飾的支架表面不斷增殖,各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)量均高于單純PCL-TPC支架。Western blot、real-time PCR等多種實(shí)驗(yàn)表明nDBM修飾的復(fù)合支架各成骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平明顯高于單純支架組。結(jié)論:采用凍干法能成功制備具有納米級(jí)別表面結(jié)構(gòu)的nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架。CCK-8、Western blot、real-time PCR等多種實(shí)驗(yàn)表明nDBM修飾的復(fù)合支架有利于BMSCs增殖并向成骨細(xì)胞方向分化。實(shí)驗(yàn)第三部分:nDBM對(duì)兔股骨和nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架對(duì)兔橈骨大段骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究目的:評(píng)價(jià)nDBM對(duì)兔股骨缺損及nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架對(duì)兔橈骨大段骨缺損的修復(fù)能力。方法:建立兔股骨缺損模型,將nDBM填充入缺損部位并設(shè)立空白對(duì)照組;建立兔橈骨大段骨缺損模型,將nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架植入缺損部位,對(duì)照組植入單純PCL-TCP支架。術(shù)后一定的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物取材,通過大體觀察,Micro CT及組織切片染色等評(píng)價(jià)材料骨缺損修復(fù)情況。結(jié)果:大體觀察見nDBM填充組骨缺損區(qū)皮質(zhì)已基本愈合;nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架組骨缺損兩端已有骨痂形成。影像學(xué)檢查提示nDBM組骨修復(fù)效果優(yōu)于空白組;nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架組骨痂明顯生成,部分支架纖維表面甚至已形成骨橋,優(yōu)于單純PCL-TCP支架。組織切片染色顯示nDBM修飾的復(fù)合支架孔隙內(nèi)大量骨細(xì)胞長(zhǎng)入、纖維形成,部分支架表面甚至形成板層骨,骨誘導(dǎo)及成骨性能均優(yōu)于單純PCL-TCP支架組。結(jié)論:nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架能有效促進(jìn)大段骨缺損區(qū)域骨再生與骨重建,PCL-TCP支架經(jīng)nDBM修飾后,骨誘導(dǎo)與骨傳導(dǎo)性明顯增強(qiáng),有利于新生骨向支架內(nèi)長(zhǎng)入。
【圖文】：

全自動(dòng)冷凍研磨儀（CryoMill，萊馳公司，，德國(guó)）

全自動(dòng)低溫高能球磨儀（E-Max，萊馳公司，德國(guó)）
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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1 林山;黃曉梅;芮鋼;尹慶水;尤元璋;;數(shù)字化珊瑚羥基磷灰石人工骨的致敏實(shí)驗(yàn)[J];中國(guó)組織工程研究;2014年25期

2 鄭曉雁;張振庭;牛景路;;國(guó)產(chǎn)碳纖維樁材料的溶血試驗(yàn)[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2013年02期

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本文編號(hào)：2655700