【摘要】：數(shù)字式生物檢測方法由于靈敏度高、能實現(xiàn)目標分子的絕對計數(shù),近年來成為體外診斷領域的重要發(fā)展方向。目前的數(shù)字式生物檢測方法(數(shù)字PCR和數(shù)字ELISA)主要通過物理隔離的方式將目標待測生物分子限制在較小空間以提高單位體積的待測分子濃度,從而實現(xiàn)單分子檢測的目的。然而,物理隔離方法(如微陣列芯片和微液滴)增加了檢測體系的復雜度以及芯片制造成本,另外生物檢測結果的重現(xiàn)性控制難度也大幅提高。因此,本文采用超亮共軛聚合物納米粒子作為信號標記材料,旨在建立一個基于微球的不需額外物理分隔的數(shù)字式生物檢測方法。首先,制備超亮共軛聚合物納米顆粒并作為生物檢測信號標記單元。通過共軛聚合物PFBT與梳狀兩親性聚合物PS-PEG-COOH共沉淀制備一系列不同粒徑的共軛聚合物納米粒子(CPNs),并探究其熒光性質隨粒徑的變化規(guī)律。研究結果表明,隨粒徑增大,CPNs能保持穩(wěn)定、優(yōu)異的光學性質,其單顆粒熒光強度隨粒徑的平方線性增長。粒徑為140 nm的CPNs能達到激光共聚焦顯微鏡的檢測限且粒徑相對較小,優(yōu)選并確定為本研究的信號標記材料。其次,建立基于微球的數(shù)字式生物檢測模式平臺。分別在微球和共軛聚合物納米粒子上修飾鏈霉親和素(SA)和生物素,得到偶聯(lián)SA的微球(微球-SA)和生物素化的CPNs(CPNs-biotin)。將CPNs-biotin以一定比例加入到微球-SA反應體系中進行親和反應,由于添加的CPNs-biotin數(shù)目遠低于微球-SA數(shù)目,確保了每個微球表面結合的CPNs-biotin至多1個。隨后,通過激光共聚焦顯微鏡檢測每個微球上的CPNs的熒光信號,結合CPNs-biotin的微球作為信號“1”,未結合CPNs-biotin的微球作為信號“0”,統(tǒng)計連接有CPNs熒光的微球數(shù)占總微球數(shù)的比例,通過泊松分布計算投入CPNs-biotin濃度,由此實現(xiàn)數(shù)字式生物檢測。實驗結果發(fā)現(xiàn)結合到微球上的CPNs-biotin數(shù)目服從泊松分布,且模擬生物檢測的檢測限達到18 aM,因此從原理上驗證了本文提出的基于微珠的數(shù)字式生物檢測方法的可行性。最后,本文以人絨毛膜促性腺激素(hCG)為待測蛋白目標分子,分別將捕獲抗體和標記抗體偶聯(lián)在微球和CPNs表面,并以微球為反應載體,同時以CPNs為檢測信號單元,建立了微球基三明治夾心數(shù)字式生物檢測方法(Beads-Digital ELISA),并初步探究了該方法的可行性。綜上,本文建立的基于微球的數(shù)字式生物檢測方法具有超高的檢測靈敏度,在體外檢測領域有巨大的應用潛力。
【圖文】：

解控二氧化硅納米粒子的 TEM 圖像，標尺 100的納米粒子粒徑分布圖。[16]ive TEM images showing the mesoporous structur (b) Particle size distribution obtained with the DL[17, 18]另辟蹊徑，，利用常用熒光染料羅丹米粒子，再通過熟化形成納米粒子的團個染料摻雜的納米粒子粒徑在 3 nm 左右。根據(jù)圖 1- 2 (b)，所合成的染料摻雜的羅丹明 6G 的 212 倍，是 30 nm CdSe@, 14]將熒光分子 BODIPY 與苯乙烯在大行 RAFT 聚合，合成了粒徑為 70 nm 的熒光強度是量子點的 200-2000 倍。

圖 1- 3 CdTe/CdS/ZnS 量子點配體轉換的過程示意圖。[22]Fig. 1-3 Reaction scheme of CdTe/CdS/ZnS QDs ligand exchange.了獲得更高熒光強度的量子點，Sheng 等人[27]將 CdSe 量子點制成納米簇 CdSe 量子點表面修飾生物素，再向體系中加入鏈霉親和素，由于一個鏈能與 4 個生物素反應，所以鏈霉親和素能將修飾生物素的不同量子點團，形成 86 nm 左右的納米簇，最后通過 SA 和生物素的親和反應修飾上胞的適配體，用于癌細胞的檢測。與單顆粒量子點相比，這種量子點納光檢測信號高出了 14 倍。有研究者將量子點裝載到氧化硅小球，使得納米粒子上富集量子點，極顆粒的熒光強度。如圖 1- 4 所示，Qian 等人[28]和 Wu 等人[29]將量子點通聯(lián)結合在氧化硅小球表面，粒徑為 100 nm 左右，在其上修飾二抗作為信料通過電化學發(fā)光法進行免疫檢測，使檢測信號得到 6.6 倍的放大。外，Ranzoni等研究人員[27]通過溶脹法將量子點摻雜到PS球中，形成200 “番木瓜粒子”（如圖 1- 5 所示），其中裝載了約 10000 個量子點，再通過合物修飾表面使其具備官能團用于接下來的生物修飾。在登革熱免疫分，它比市售最佳檢測試劑的信號強度高出 4 倍，將檢測限提高了 15 倍。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

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