【摘要】：隨著社會條件的改善和人們生活質(zhì)量的提高,由不規(guī)律的飲食習(xí)慣和低頻率的運動鍛煉所引起的心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號殺手。盡管人工血管在一定程度上緩解了血管移植手術(shù)中供體短缺的嚴(yán)峻壓力,為心血管疾病的治療提供了新的手段,但是其在植入人體后期所引起的血栓和再狹窄問題始終無法完全避免。在了解到血管內(nèi)皮層對于抑制血栓形成以及維持人工血管長期通暢性的重要意義之后,科學(xué)家們開始致力于對組織工程血管實現(xiàn)快速內(nèi)皮化的研究。細(xì)胞在組織工程血管表面內(nèi)皮化的過程主要包括三個重要步驟:1,血液中的干細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)通過與人工血管之間的相互作用粘附在其表面并進(jìn)行大面積的遷移;2,干細(xì)胞完成向ECs的定向分化;3,分化后的細(xì)胞長期保持ECs的功能性并分泌產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)和生長因子。而如何有效得完成上述三個步驟并提高其效率也正是目前血管組織工程領(lǐng)域中的研究熱點和難點。針對以上所述問題,本文以人工合成高分子材料聚己內(nèi)酯(PCL)為研究對象,利用靜電紡絲技術(shù)將其制備成三維多孔纖維支架,并在工程科學(xué)的知識范疇內(nèi)對PCL纖維支架進(jìn)行改性,從而提高PCL復(fù)合纖維支架對間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的粘附、增殖和定向分化等行為的調(diào)控作用。本文主要研究工作如下:第一部分聚己內(nèi)酯/明膠(PCL/Gelatin)復(fù)合纖維支架的制備及其對MSCs生長行為的影響。目前,由人工合成高分子材料所制備而成的組織工程支架已經(jīng)被廣泛用于科學(xué)研究和臨床實驗,然而,其生物相容性和生化功能性的不足依然是限制其進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵因素。利用天然高分子材料來改善人工合成高分子材料的生物相容性和生化功能性被認(rèn)為是最有效的解決途徑之一。筆者在這一部分研究中將不同比例的Gelatin與PCL共混,然后將其制備成復(fù)合電紡纖維支架,通過Gelatin分子鏈中的多肽序列為MSCs的粘附和遷移提供生物著位點,借此提高PCL電紡支架的生物相容性;此外,隨著復(fù)合體系中明膠含量的變化,PCL電紡支架的表面潤濕性能、結(jié)晶性能和力學(xué)性能均有不同程度的改善。本部分研究不僅證實了Gelatin能夠增強(qiáng)MSCs與PCL/Gelatin復(fù)合纖維支架之間的相互作用力,也為PCL/Gelatin復(fù)合纖維支架在血管組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)指導(dǎo)。第二部分通過對纖維支架表面硬度的調(diào)控來誘導(dǎo)MSCs向ECs的定向分化行為。除了生長因子之外,多功能干細(xì)胞向成體細(xì)胞的分化行為同樣受細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的影響,因此,利用組織工程支架的固有屬性聯(lián)合生長因子的協(xié)同刺激能夠增強(qiáng)多功能干細(xì)胞的定向分化效率。在這一部分研究中,筆者采用了一種簡單便捷的退火方法對聚己內(nèi)酯/聚乳酸(PCL/PLA)復(fù)合纖維支架進(jìn)行了不同時長的后處理,借此調(diào)節(jié)組織工程支架的表面硬度,然后將MSCs接種在具有不同表面硬度的支架上進(jìn)行分化誘導(dǎo),實驗結(jié)果表明在表面硬度較高的纖維支架上生長的干細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多的內(nèi)皮細(xì)胞特征基因和蛋白,包括血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子(CD31)和血管性血友病因子(vWF),證明了纖維支架表面硬度對MSCs向ECs分化過程的調(diào)控作用。該研究為血管組織工程內(nèi)膜支架的設(shè)計制備以及支架內(nèi)皮化的進(jìn)一步實現(xiàn)提供了實驗指導(dǎo)。第三部分探究纖維支架表面硬度影響MSCs向ECs分化行為的潛在信號通道。利用組織工程支架的固有特性,如物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)等,來影響并調(diào)控多功能干細(xì)胞向成體細(xì)胞的定向分化行為在組織工程領(lǐng)域和干細(xì)胞治療領(lǐng)域中具有重要的研究意義。然而到目前為止,干細(xì)胞分化過程中所涉及的潛在誘導(dǎo)機(jī)理以及復(fù)雜的信號通路仍未被徹底得、明確得揭示。結(jié)合本文第二部分研究所得出的結(jié)論,即纖維支架表面硬度的增加能夠提高骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的程度,筆者在這一部分引入了小分子核酸干擾技術(shù)(siRNA)對其所涉及的信號通路進(jìn)行了研究。通過siRNA分別對MSCs中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)的信使核糖核酸(m RNA)進(jìn)行抑制,然后將抑制前后的干細(xì)胞分別接種在具有不同表面硬度的兩組纖維支架表面進(jìn)行分化誘導(dǎo),實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)MSCs中的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子信使核糖核酸(MIF-mRNA)受到抑制時,生長在兩組支架表面的干細(xì)胞中所產(chǎn)生VEGF、CD31和vWF三種基因和蛋白含量并沒有明顯差異;而當(dāng)MSCs中的血管內(nèi)皮生長因子信使核糖核酸(VEGF-mRNA)受到抑制時,生長在兩組支架表面的干細(xì)胞中幾乎無法產(chǎn)生CD31和vWF兩種基因和蛋白,但是VEGF基因和蛋白變化趨勢并沒有受到影響。上述結(jié)果證明纖維支架的表面硬度能夠通過MIF-VEGF-CD31/vWF這一信號通道來調(diào)節(jié)MSCs向ECs的定向分化,該部分研究也為干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)調(diào)控提供了一定的借鑒數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。第四部分具有生長因子緩釋功能的纖維支架對MSCs向ECs分化行為的影響以及后期功能的穩(wěn)定維持。無論是在細(xì)胞自身的生長過程還是細(xì)胞與組織工程支架相互作用的階段,生長因子都發(fā)揮著極其重要的作用。然而在實際操作過程中,生長因子往往是通過實驗者額外被添加到培養(yǎng)體系中,伴隨著生長因子的快速降解,其影響作用也隨之減弱甚至逐漸消失。因此,具有生長因子修飾和緩釋特征的功能化組織工程支架越來越受到人們的關(guān)注。在這一部分,筆者結(jié)合了前三部分的研究結(jié)果,將VEGF包裹在Gelatin制成的納米顆粒中,并利用靜電紡絲過程中的電場力使這些含有生長因子的納米顆粒分散在PCL電紡纖維中。筆者通過實驗發(fā)現(xiàn)這種具有生長因子修飾和緩釋功能的復(fù)合纖維支架(PCL/VGPs)不僅能夠誘導(dǎo)MSCs向ECs進(jìn)行定向分化,同時能夠有效的長久維持ECs所形成的血管化結(jié)構(gòu)。本部分結(jié)果證實了PCL/VGPs功能化支架同時具有對MSCs分化前期的誘導(dǎo)作用以及分化后期的維穩(wěn)作用,為血管組織工程支架的優(yōu)化和進(jìn)一步實現(xiàn)內(nèi)皮化提供了新的實驗思路。
【圖文】：

1 緒論于將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的健康組織細(xì)胞與由生物材料所制備的三維多孔支架整合在一起，在一定的生化環(huán)境和刺激下建立具有生物活性和生物功能性的組織和器官，從而對病損部位進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面的重建并達(dá)到永久性的替代效果[14-16]，如圖 1.1 所示[17]。組織工程科學(xué)吸收了現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、材料學(xué)以及工程科學(xué)等眾多學(xué)科的先進(jìn)研究成果并加以融合，順應(yīng)了如今多學(xué)科交叉滲透發(fā)展的潮流，同時又能根據(jù)其在使用過程中遇到的各種難題對各個學(xué)科的發(fā)展提出了更高標(biāo)準(zhǔn)的要求，繼而帶動了各個學(xué)科的持續(xù)進(jìn)步，被譽(yù)為是繼細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)之后生命科學(xué)領(lǐng)域的又一個里程碑。組織工程科學(xué)不僅為當(dāng)今的臨床治療壓力提供了新的緩解方法，為廣大患者的康復(fù)和長久健康提供了希望，同時也促進(jìn)了各個學(xué)科之間的協(xié)調(diào)發(fā)展。因此，，對組織工程科學(xué)的研究將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效應(yīng)，具有重要的科研價值和現(xiàn)實意義。

方面具有明顯的優(yōu)點：1) 它能夠利用較少的組織細(xì)胞，通過體外擴(kuò)增培養(yǎng)后完成對大面積缺損組織的修復(fù)[18]；2）它可以按照病損組織或器官的形狀進(jìn)行定制，從而達(dá)到完美的形態(tài)修復(fù)效果[19]；3）它可以形成具有生物活性以及生物功能性的組織和器官，繼而對病損部位進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建，甚至是永久性的替代�；诮M織工程科學(xué)的種種優(yōu)勢，在隨后的幾十年里，該學(xué)科在全世界范圍內(nèi)得到了快速高效的發(fā)展，并取得了一系列重要的研究成果[20, 21]。早在 1991 年，美國科學(xué)家 CimaL.R.等人就嘗試?yán)镁垡掖妓幔≒olyglycolicAcid, PGA）基體與軟骨細(xì)胞結(jié)合的方法來制備組織工程軟骨，并將其移植入小鼠體內(nèi)進(jìn)行康復(fù)治療[22]。1994 年，組織工程重大研究項目在中國立項，標(biāo)志著國內(nèi)組織工程研究的正式起步。到了 1997 年，中國學(xué)者曹誼林博士在 Joseph P.Vacanti 的實驗室成功地將組織工程化人耳培養(yǎng)在裸鼠背部（如圖 1.2 所示）[23]，引起了全世界人民對組織工程科學(xué)的強(qiáng)烈反響；同年，美國食品與藥物管理局（FoodandDrugAdministration,FDA）對自體軟骨細(xì)胞移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損這一方案進(jìn)行了批準(zhǔn)，組織工程產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化從此拉開了序幕。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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2 王佃亮;;組織工程的誕生與發(fā)展——組織工程連載之一[J];中國生物工程雜志;2014年05期

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本文編號：2628709