【摘要】：背景和目的:近年來,骨組織工程因組織來源豐富、無繼發(fā)感染等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)從而成為骨缺損治療的研究熱點(diǎn)。支架是骨組織工程的重要組成因素之一,骨再生所需工程支架材料需具有三維多孔互聯(lián)結(jié)構(gòu)、良好生物相容性及可降解性、可有效負(fù)載及持續(xù)釋放生長因子、良好骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性等重要特性。故目前在骨組織工程研究中如何構(gòu)建符合上述原則的支架材料是研究的熱點(diǎn),其中賦予支架材料良好的成骨活性(骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性)是骨組織工程支架設(shè)計(jì)的難點(diǎn)和重點(diǎn)。聚己內(nèi)酯是一種有機(jī)高分子材料,用其制備的靜電紡絲納米纖維支架具有良好的生物相容性及機(jī)械強(qiáng)度、多孔互聯(lián)結(jié)構(gòu)及高效的比表面積并可負(fù)載多種生長因子等特性,可較好模擬骨組織天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。然而其弱親水性、降解產(chǎn)物的酸性等特性限制了其使用。而納米羥基磷灰石(Nano-hydroxyapatite,nHA)是骨基質(zhì)的主要無機(jī)成分,與黏附蛋白有很好的親和力并在成骨細(xì)胞的分化、礦化中發(fā)揮重要作用,同時(shí)其偏堿性的特性可有效中和有機(jī)聚合物降解過程中的產(chǎn)酸,使其成為充當(dāng)骨傳導(dǎo)性的理想材料,然而其機(jī)械強(qiáng)度較低易碎限制了其應(yīng)用。近來研究表明,通過相分離、靜電紡等技術(shù)將納米羥基磷灰石等生物陶瓷與有機(jī)高分子材料結(jié)合,形成含有納米級(jí)生物陶瓷的聚合物復(fù)合材料,可較好的發(fā)揮陶瓷材料與高分子材料的優(yōu)點(diǎn)。骨組織再生是新骨形成的過程,需要多種生長因子的參與,其中尼爾樣1型分子(Nel-like molecule 1,NELL-1)是新發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)骨形成的生長因子,參與成骨細(xì)胞的募集、增殖、分化、礦化及細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)的相互作用。NELL-1處于Cbfa1/Runx2的下游,與BMP-2相比,其不存在異位成骨,且其誘導(dǎo)形成的骨質(zhì)更致密。骨組織工程設(shè)計(jì)的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境體系和骨生化信號(hào)分子體系重建與再生,以快速實(shí)現(xiàn)骨組織再生�；谝陨险J(rèn)識(shí),本研究分三個(gè)部分構(gòu)建具有生物活性的支架材料。第一部分首先通過去溶劑法制備負(fù)載NELL-1的BSA凝聚體,再將殼聚糖通過靜電吸附作用包被及穩(wěn)定BSA凝聚體形成殼聚糖納米微球,形成生長因子釋放的第一層屏障。第二部分采用靜電紡絲技術(shù)將不同質(zhì)量的納米羥基磷灰石與PCL制備成含有納米級(jí)生物陶瓷的聚合物納米復(fù)合材料,以期結(jié)合二者的優(yōu)點(diǎn)為骨缺損修復(fù)提供新的具有骨傳導(dǎo)性的支架材料。第三部分經(jīng)靜電紡絲技術(shù)將殼聚糖微球及nHA嵌入聚己內(nèi)酯聚合物纖維支架,形成生長因子釋放的雙層保護(hù)屏障,并賦予納米纖維支架骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性,進(jìn)而構(gòu)建符合骨組織再生所需的仿生微環(huán)境,以期為骨缺損的修復(fù)提供新的支架材料和生長因子載藥和釋放方式,為骨缺損修復(fù)提供新的研究思路。本研究的目的如下:(1)構(gòu)建負(fù)載NELL-1蛋白的納米微球,形成生長因子釋放的第一層屏障,檢測(cè)微球的材料表征、生長因子體外釋放及體外生物活性。(2)制備富含納米羥基磷灰石的PCL復(fù)合纖維支架材料,賦予材料骨傳導(dǎo)性,檢測(cè)和評(píng)價(jià)不同nHA含量的復(fù)合支架材料的理化表征、生物相容性并探討復(fù)合支架材料對(duì)MC3T3-E1前體成骨細(xì)胞黏附、增殖、分化及成骨相關(guān)基因(RUNX2、OPN、COL1)表達(dá)的影響。(3)構(gòu)建富含納米羥基磷灰石并緩釋NELL-1蛋白的復(fù)合纖維支架材料,形成生長因子釋放的雙層保護(hù)屏障,賦予納米纖維支架骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性,評(píng)價(jià)支架材料的理化表征及生物相容性,并檢測(cè)復(fù)合支架材料中NELL-1蛋白的緩釋效果,探討復(fù)合支架材料對(duì)MC3T3-E1前體成骨細(xì)胞黏附生長、增殖、分化及成骨相關(guān)基因(RUNX2、OPN、COL1)表達(dá)的影響。材料與方法:(1)首先采用去溶劑法及自組裝技術(shù)制備負(fù)載NELL-1的殼聚糖納米微球(Chi/NNPs),采用透射電鏡、納米粒度儀、ART-FTIR、CLSM檢測(cè)微球的材料表征,用NELL-1 Elisa Kit檢測(cè)微球的包封率及體外蛋白釋放,通過檢測(cè)小鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)評(píng)價(jià)釋放NELL-1的生物活性。(2)采用靜電紡絲技術(shù)將不同質(zhì)量的納米羥基磷灰石與PCL制備成復(fù)合纖維支架材料,通過SEM、TEM、拉伸強(qiáng)度檢測(cè)、ART-FTIR、接觸角儀及親水率檢測(cè)等評(píng)價(jià)復(fù)合支架材料的表征,用CCK-8試劑盒及CLSM檢測(cè)評(píng)價(jià)支架材料上MC3T3-E1粘附生長及材料毒性情況,采用茜素紅染色、ALP試劑盒及RT-PCR檢測(cè)不同復(fù)合支架材料對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化、礦化的影響。(3)采用靜電紡絲技術(shù)將Chi/NNPs及nHA嵌入聚己內(nèi)酯復(fù)合纖維支架,通過SEM、TEM、拉伸強(qiáng)度檢測(cè)、接觸角儀及親水率檢測(cè)評(píng)估材料的表征,NELL-1 Elisa Kit檢測(cè)復(fù)合支架材料體外釋放NELL-1的緩釋效果,采用CCK-8試劑盒、CLSM、SEM檢測(cè)評(píng)估MC3T3-E1細(xì)胞在復(fù)合材料粘附生長、粘附伸展及材料的毒性情況,采用ALP試劑盒及RT-PCR評(píng)價(jià)不同復(fù)合支架材料對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化、礦化的影響。結(jié)果:(1)第一部分實(shí)驗(yàn):TEM結(jié)果顯示,Chi/NNPs與Chi/BNPs可形成納米微球結(jié)構(gòu),表面具有明顯的被殼聚糖包被的圖像,形態(tài)穩(wěn)定,呈球形、光滑、無團(tuán)聚。ART-FTIR顯示殼聚糖、BSA蛋白的光譜特征峰可以在殼聚糖納米微球的光譜中觀察到。CLSM鏡下可見殼聚糖包被的納米顆粒均勻分散在玻璃片上,沒有明顯的團(tuán)聚,綠色熒光顏色在納米顆粒上的均勻分布表明殼聚糖在BSA顆粒上均勻分布。粒徑結(jié)果顯示Chi/BNPs 粒徑為 378.726 ±13.140nm、Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)粒徑分別為 368.663±15.470nm、382.881 ± 18.767nm、390.480±11.465nm,這四組的粒徑無差異但均比BSA凝聚體的直徑大,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Chi/BNPs各組的 PDI 值為 0.378±0.029、Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)組分別為0.379±0.017、0.388±0.039、0.462±0.030,均小于 0.5,而 BNPs 的 PDI 值為 0.669±0.072。Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)的 zeta 電位分別+25.03±1.42mV、+30.27±1.80mV、+31.03±2.05mV,Chi/BNPs 及 BNPs 的 zeta電位為+29.03.03±2.15mV、+23.067±2.54mV。Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)包封率分別為88.50±3.63%、89.30±3.82%、87.83±3.50%,組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。體外累計(jì)釋放曲線顯示NELL-1可以持續(xù)釋放192h以上,釋放初期突釋不明顯,在0.15%殼聚糖組和0.3%殼聚糖組之間存在相似的釋放曲線,兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與新鮮NELL-1溶液相比,從Chi/NNPs(0.15%)0～2d 釋放的 NELL-1 的 ALP 活性分別為 93.18±8.99%、3～5d為85.35±5.84%、6～8d為82.67±8.74%。統(tǒng)計(jì)分析顯示,在整個(gè)釋放期間,從Chi/NNPs釋放的NELL-1的生物活性高于陰性對(duì)照組(Chi/BNPs)(P0.05)。新鮮NELL-1溶液的生物活性高于其他三組釋放的NELL-1溶液,但統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異(P0.05)。(2)第二部分實(shí)驗(yàn):SEM鏡下可見制備的纖維支架呈現(xiàn)無序的三維交錯(cuò)結(jié)構(gòu),纖維與纖維之間交錯(cuò)成網(wǎng)狀。PCL 組、PCL+10%nHA 組、PCL+20%nHA 組、PCL+30%nHA、PCL+40%nHA組的纖維直徑分別為 550.90±37.43nm、572.44±35.27nm、581.38±40.58nm、617.18±30.17nm、630.02±60.53nm。TEM 顯示純 PCL 表面光滑,而富含 nHA 的PCL組表面略顯粗糙,且可觀察到纖維內(nèi)部有較多的nHA的排列聚集,尤其以PCL+30%nHA組及PCL+40%nHA組效果顯著,且其表面的粗糙程度更明顯。ART-FTIR結(jié)果顯示nHA的代表性官能團(tuán)主要有OH-1、PO43-,純PCL的主要官能團(tuán)有C=O、C-H、C-O等,在不同含量的nHA的PCL中,可以發(fā)現(xiàn)含有nHA及PCL的主要官能團(tuán),可見在靜電紡絲制作過程中PCL可將nHA嵌入其中且PCL和nHA的結(jié)構(gòu)成分未發(fā)生明顯變化。拉伸強(qiáng)度結(jié)果顯示PCL組強(qiáng)度最高,達(dá)到14.98±1.13MPa。隨加入nHA量的增加,富含nHA的PCL拉伸強(qiáng)度逐漸降低。PCL+40%nHA組拉伸強(qiáng)度最低,低至6.02±0.98 MPa。接觸角檢測(cè)可見PCL的接觸角較大,隨著nHA加入量的增加,復(fù)合支架材料接觸角明顯減小,PCL+30%nHA組、PCL+40%nHA組的親水性明顯提高。進(jìn)一步的吸水率檢測(cè)結(jié)果表明,隨nHA加入量的增加,材料的吸水率明顯增加,PCL+30%nHA組、PCL+40%nHA組的吸水率明顯高于PCL組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CLSM結(jié)果顯示隨著PCL中加入nHA量的變化,細(xì)胞粘附數(shù)量明顯增加,細(xì)胞在PCL+30%nHA組、PCL+40%nHA組的數(shù)量最多,即PCL中引入羥基磷灰石能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的粘附伸展。CCK-8的結(jié)果表明nHA加入PCL可明顯提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞在支架表面的生長增殖,即nHA嵌入的復(fù)合支架材料是沒有毒性的。茜素紅染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨nHA含量的增加,礦化作用愈明顯,可見纖維支架上具有更多的鈣鹽沉積,PCL+30%nHA、PCL+40%nHA纖維支架上的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和大小明顯高于純PCL纖維支架。nHA的加入可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞ALP的表達(dá),PCL+30%nHA、PCL+40%nHA組的ALP表達(dá)升高更顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR顯示14天時(shí)RUNX2 mRNA在含nHA的PCL復(fù)合纖維支架中表達(dá)明顯升高且nHA含量越大RUNX2 mRNA高表達(dá)越明顯。而在21d時(shí),RUNX2 mRNA在含nHA的PCL復(fù)合纖維支架中表達(dá)明顯下降,且nHA含量越大RUNX2 mRNA低表達(dá)越明顯。COL1在含nHA的PCL復(fù)合纖維支架中隨時(shí)間的推移(7d、14d、21d)表達(dá)逐漸升高,在nHA高含量組中其表達(dá)升高明顯。在接種14d時(shí),PCL+30%nHA組及PCL+40%nHA組的OPN mRNA表達(dá)升高,在21d,含有nHA的各組(10%nHA組除外)的OPN表達(dá)高于純PCL組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,nHA含量較高的PCL+30%nHA組及PCL+40%nHA組尤其顯著。(3)第三部分實(shí)驗(yàn):SEM鏡下所示,各組靜電紡絲呈現(xiàn)無序結(jié)構(gòu),纖維與纖維之間交錯(cuò)成網(wǎng)狀。純 PCL 組、PCL/nHA 組、PCL/BNPs 組、PCL/NNPs 組、PCL/nHA/NNPs 組的靜電紡絲纖維的直徑分別為 550.90±37.43nm、617.18±30.17nm、680.23±29.36nm、689.36±37.04nm、702.72±34.24nm,可見微球的嵌入使PCL纖維直徑明顯增大且高于純PCL組(P0.05)。TEM鏡下可見純PCL纖維支架材料粗細(xì)較均勻,纖維表面也較光滑;富含nHA的PCL纖維支架有一定的團(tuán)聚;納米微球(BNPs或NNPs)嵌入的靜電紡絲纖維表面略有突起,直徑變粗;微球及nHA被PCL包裹其中。拉伸強(qiáng)度的結(jié)果顯示nHA、微球的加入可使纖維的拉伸強(qiáng)度降低。接觸角及吸水率的結(jié)果顯示在滴加ddH20 3min后,除PCL組外,其余各組的接觸角均有明顯降低均小于90°,親水性明顯增加。含有nHA或納米微球的各組靜電紡絲纖維的吸水率明顯高于純PCL組。體外藥物釋放結(jié)果顯示PCL/nHA/NNPs組可使藥物低濃度持續(xù)釋放達(dá)30天,釋放量達(dá)到90%以上,PCL/NNPs組與PCL/nHA/NNPs組的釋放曲線相似,可明顯降低藥物的突釋。CLSM鏡下觀察可見細(xì)胞在支架材料有明顯地粘附生長,含有nHA或微球的各組細(xì)胞數(shù)量較多,多于純PCL組。掃描電鏡檢查結(jié)果顯示MC3T3-E1細(xì)胞在支架材料上有細(xì)胞偽足的伸出,形態(tài)較好,鋪展面積較大。CCK-8結(jié)果顯示nHA及納米微球嵌入PCL并未降低支架材料的生物相容性,可明顯促進(jìn)細(xì)胞的粘附增殖。ALP檢測(cè)可見含有nHA或NNPs微球各組有明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞ALP表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示接種細(xì)胞7天時(shí),PCL/nHA組、PCL/NNPs組、PCL/nHA/NNPs組的COL1mRNA表達(dá)水平均高于純PCL組及PCL/BNPs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。接種14、21天天,可見PCL/nHA組、PCL/NNPs組、PCL/nHA/NNPs組的COL1mRNA表達(dá)水平均高于純PCL組及PCL/BNPs組,PCL/nHA/NNPs組的COL1 mRNA表達(dá)水平也高于PCL/nHA組,以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05)。接種7天時(shí),各組OPNmRNA低表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接種 14d 時(shí),PCL/nHA 組、PCL/NNPs 組、PCL/nHA/NNPs 組的 OPN mRNA表達(dá)水平均高于純PCL組及PCL/BNPs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而純PCL組與PCL/BNP組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。接種21d時(shí),PCL/nHA組、PCL/NNPs組、PCL/nHA/NNPs組的OPN mRNA表達(dá)水平均高于純PCL組及PCL/BNPs組,PCL/nHA/NNPs組的OPN mRNA表達(dá)水平亦高于PCL/nHA組,以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MC3T3-E1細(xì)胞接種7d、14d時(shí),RUNX2mRNA在PCL/nHA組與PCL/nHA/NNPs組RUNX2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于其余三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。接種21d時(shí),RUNX2mRNA的表達(dá)明顯下降,PCL/nHA組與PCL/nHA/NNPs組RUNX2 mRNA的表達(dá)水平明顯低于其余三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)殼聚糖成功包被在BSA凝聚體表面形成納米微球,其形態(tài)穩(wěn)定,呈球形、光滑、無團(tuán)聚,粒徑適中,具有較高的包封率,可形成生長因子釋放的保護(hù)屏障進(jìn)而較好的緩釋NELL-1蛋白的釋放,且釋放的NELL-1具有較高的生物活性。這為生長因子在組織再生的應(yīng)用提供了新的載藥和緩釋方式,從而可為骨組織再生提供負(fù)載生長因子的生物活性材料,為骨缺損修復(fù)的研究奠定基礎(chǔ)。(2)nHA嵌入的PCL復(fù)合支架材料具有具有三維交聯(lián)的結(jié)構(gòu)、纖維直徑分布較均勻、形態(tài)較一致,具有較好的親水性、較好的拉伸強(qiáng)度(PCL+40nHA組除外)、良好的生物相容性,nHA高含量的復(fù)合纖維支架(PCL+30%nHA組及PCL+400%nHA組)更有利于MC3T3-E1細(xì)胞的粘附生長增殖,顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞ALP及成骨相關(guān)基因(RUNX2、OPN、COL1)mRNA的表達(dá),可明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨向分化成熟及礦化。綜合材料表征及生物活性,PCL+30%nHA組既具有良好的三維結(jié)構(gòu)、較強(qiáng)的親水性及適宜的機(jī)械強(qiáng)度,又具有明顯的促進(jìn)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞粘附生長、增殖及成骨向分化,是較理想的富含納米級(jí)生物陶瓷的聚合物復(fù)合材料,這可為骨缺損的修復(fù)提供新的支架材料。(3)nHA及NELL-1微球嵌入的PCL纖維支架三維交錯(cuò)成網(wǎng)狀、nHA及微球成功包裹于PCL纖維中,具有良好的潤濕性、拉伸強(qiáng)度及生物相容性,可明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞在支架的粘附生長增殖。殼聚糖微球和PCL纖維支架為NELL-1的釋放形成雙層保護(hù)屏障,可有效的延長生長因子的釋放時(shí)間,釋放的NELL-1蛋白可提高ALP的表達(dá)說明釋放的生長因子保持有良好的生物活性。nHA及NELL-1微球嵌入的PCL纖維支架促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)基因(RUNX2、OPN、COL1)的表達(dá),促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化成熟,構(gòu)建的復(fù)合纖維具有良好的成骨活性,這可為骨缺損的修復(fù)提供較理想的支架材料。
【圖文】：

與其他制備纖維支架的技術(shù)如相分離、自組裝等技術(shù)相比，靜電紡絲技術(shù)制逡逑備的纖維支架材料具有較一致的纖維直徑、形態(tài)及孔隙率結(jié)構(gòu)［ｍ１。靜電紡絲技術(shù)逡逑的基本原理（如圖１所示）是在高壓電場(chǎng)作用下，針頭處的液滴會(huì)由球形變?yōu)閳A逡逑錐形（Ｔａｙｌｏｒ錐），圓錐狀的帶電液體通過電場(chǎng)并拉伸形成一個(gè)向收集器噴射逡逑的稀薄液體噴射流，該液體多為聚合物溶液，其中溶劑在噴射過程中蒸發(fā)，聚合逡逑物溶液連續(xù)噴射，形成連續(xù)的交聯(lián)的纖維支架結(jié)構(gòu)，形成的纖維支架直徑一般在逡逑１０邋ｎｍ邋到邋１０邋ｙ邋ｍ邋之間ｎｎ。逡逑１６逡逑

圖１．１殼聚糖包被的ＢＳＡ微球的制備示意圖逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 賈駿;段Z腪，

本文編號(hào)：2628443