【摘要】：目的:1)探討基于明膠微載體3D細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢。2)研究基于明膠微載體構(gòu)建3D細(xì)胞球在組織工程神經(jīng)中對神經(jīng)再生的修復(fù)效果。方法:取(48小時)SD乳鼠腹股溝脂肪,剪碎消化后進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)到P1代,然后將明膠微載體復(fù)合P1代脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells ADSCs)在生物反應(yīng)器中進(jìn)行3D動態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建3D細(xì)胞球。在體外,為了評價3D細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢,本實(shí)驗(yàn)從增殖、凋亡、干細(xì)胞基因的維持以及干細(xì)胞功能方面進(jìn)行比較。取P1代ADSCs 50 x 10~4個分別進(jìn)行傳統(tǒng)的2維(2 Dimension 2D)以及3D培養(yǎng),培養(yǎng)時間分別為1,3,5,7天,在這4個時間點(diǎn)中分別取2D,3D培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),用PCR檢測干細(xì)胞干性基因的表達(dá)情況,并用凋亡試劑盒(FITC/PI)檢測兩種不同培養(yǎng)方式細(xì)胞的凋亡情況。而干細(xì)胞的功能比較時,將構(gòu)建好的3D細(xì)胞球以及2D培養(yǎng)的細(xì)胞分別放入transwell的上層與背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng),對比2D,3D兩種細(xì)胞對背根神經(jīng)節(jié)軸突生長的效果。在體內(nèi),建立大鼠坐骨神經(jīng)缺損的模型(n=48),長度為15mm,隨機(jī)分成4組,分別注射入3D細(xì)胞球(3D組),2D細(xì)胞(2D組),單純殼聚糖導(dǎo)管組(chitosan conduit,conduit組)以及自體神經(jīng)(autologous nerve grafts,autogrft組)橋接神經(jīng)缺損。術(shù)后觀察12周后取材,通過神經(jīng)電生理、腓腸肌肌肉濕重恢復(fù)率以及組織學(xué)分析(甲苯胺藍(lán)染色、免疫熒光染色、透射電鏡掃描)等方法對比評價3D脂肪干細(xì)胞球作為種子細(xì)胞注射入殼聚糖導(dǎo)管中修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的效果。結(jié)果:基于明膠微載體的3D細(xì)胞動態(tài)培養(yǎng)與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)相比,細(xì)胞增殖能力更快,使細(xì)胞凋亡速度減慢,對干細(xì)胞干性基因表達(dá)的維持能力更強(qiáng)。3D細(xì)胞球較2D細(xì)胞更能夠加速DRG軸突的生長。術(shù)后12周取材,3D組和autograft組的神經(jīng)電生理、腓腸肌肌肉濕重恢復(fù)率及病理學(xué)觀察等檢測的結(jié)果都要明顯優(yōu)于2D和conduit組;3D組和autograft組比較存在明顯的差異,且后者明顯優(yōu)于前者;但2D和conduit組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)基于明膠微載體構(gòu)建3D細(xì)胞球進(jìn)行動態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)具有細(xì)胞增殖能力快、降低凋亡速率、更好的維持干細(xì)胞的干性以及提高了干細(xì)胞的功能,能夠很好的充當(dāng)干細(xì)胞應(yīng)用到組織工程神經(jīng)研究中,其療效明顯優(yōu)于2D細(xì)胞組。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2.1.2 明膠顯微結(jié)構(gòu)及 3D 脂肪干細(xì)胞球構(gòu)建1）明膠微載體的掃描電鏡圖片顯示其孔隙率高、增加其表面積為容納更多細(xì)胞提供了基礎(chǔ)（圖 1-3）。2）基于明膠微載體的 3D 細(xì)胞動態(tài)培養(yǎng) 3 天后，死活染色劑染色后觀察 3D 細(xì)胞的構(gòu)建情況如圖 1-4，，染色后細(xì)胞染成紅色或者綠色表明細(xì)胞吸附到明膠微載體上，如圖 1-3，其中紅色代表細(xì)胞死亡，綠色代表細(xì)胞存活。3）計(jì)算培養(yǎng) 3 天的脂肪干細(xì)胞球的死活比例：計(jì)算公式為紅色細(xì)胞/明膠微載體上所有細(xì)胞總數(shù)，得出明膠微載體培養(yǎng)的死亡比例，經(jīng)過計(jì)算得出死亡細(xì)胞為1%。

其中紅色代表細(xì)胞死亡，綠色代表細(xì)胞存活。養(yǎng) 3 天的脂肪干細(xì)胞球的死活比例：計(jì)算公式為紅色細(xì)胞總數(shù)，得出明膠微載體培養(yǎng)的死亡比例，經(jīng)過計(jì)算得出死圖 1-3 明膠微載體電鏡圖，顯示明膠顯微結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08;R688

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本文編號：2609778